Lección 2.1.

Manipulación de ácidos nucleicos

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

Inma Quilis Bayarri

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular
Universitat de València
¿Qué significa manipular ácidos nucleicos?

Cada día en los laboratorios de Biología Molecular de todo el mundo se realizan una serie
de procesos básicos entre los que está sin duda la manipulación de ácidos nucleicos.
¿Qué es un ácido nucleico?

Existen dos tipos de ácido nucleico, el ribonucleico (RNA) y el desoxirribonucleico (DNA).

Cada uno de ellos es una cadena polimérica de unidades monoméricas conectadas por
enlaces covalentes (enlace fosfodiéster) que constan de:
AZÚCAR de 5 carbonos (ribosa en el RNA y 2´-desoxirribosa en el DNA)
BASE NITROGENADA (A,G,C y U en el RNA; A,G,C y T en el DNA)
GRUPO FOSFATO (que confiere el carácter ácido y la carga negativa).
Etapas básicas para la extracción y purificación de AN
¿Cómo los extraemos de la célula?

El primer paso consiste en acceder a nuestro material de interés y para ello, según el tipo
de muestra hemos de conseguir LISAR LAS CÉLULAS.
Esto se consigue de forma sencilla en el caso de bacterias (lisis con SDS) o células
animales (lisis directa al eliminar el medio de cultivo) pero puede ser algo más complicado
en el caso de células vegetales o levaduras que presentan pared y precisan una rotura
mecánica para eliminarla.
¿Cómo lo separamos del resto de los componentes celulares?

Los componentes celulares que no son de interés deben ser eliminados, esto se consigue
añadiendo distintos reactivos:
Los LÍPIDOS de las membranas celular y nuclear con detergentes y surfactantes.
Las PROTEÍNAS añadiendo proteasas.
Si nuestro objetivo es el DNA se puede eliminar el RNA añadiendo RNasa.
La solución se trata entonces con sal a alta concentración para conseguir que todo el
material no deseado agregue junto. Depués mediante centrifugación será separado del
DNA.
¿Cómo lo separamos del resto de los componentes celulares?

La purificación del DNA de los detergentes, proteínas, sales y reactivos empleados durante
la lisis celular se realiza por distintos procedimientos. Los más comunes son:
1. Precipitación con Etanol frío o Isopropanol. El DNA es insoluble en estos alcoholes
por lo que precipitará y podrá ser separado por centrifugación.
La precipitación se potencia añadiendo fuerza iónica (normalmene acetato sódico).
2. Extracción con Fenol-Cloroformo. El fenol desnaturaliza las proteínas de la muestra y
tras centrifugar permanecen en la fase orgánica mientras el DNA se encuentra en la fase
acuosa junto al cloroformo que eliminará los restos de fenol de la solución.
3. Purificación en columna. Se basa en el hecho de que los AN pueden unirse por
adsorción a fases sólidas dependiendo del pH y la concentración salina del tampón.
¿Cómo lo separamos del resto de ácidos nucleicos?

Existen diferencias entre el DNA y el RNA que permiten su separación.

Los AN son muy sensibles a NUCLEASAS por eso durante su manipulación debemos
extremar el cuidado para protegerlos de ellas. En el momento que se requiera trataremos
la muestra con RNasa o con DNasa.
¿Cómo lo comprobamos?

Se basa en la fuerte absorción de luz

a =260nm del DNA/RNA.
Existen espectofotómetros
especializados para estas medidas.
¿Cómo lo identificamos y/o modificamos?

Una vez aislamos nuestro DNA/RNA puede tener distintos destinos según el problema u
objetivo que se plantee. Muchas de estas técnicas y aplicaciones las veremos en las
lecciones siguientes.

INGENIERÍA GENÉTICA ESTUDIOS ÓMICOS

Tecnología del DNA Técnicas de

Recombinante Secuenciación

Enzimas de
PCR CRISPR Sanger Microarrays NGS
Restricción
Referencias bibliográficas y enlaces

Links:

Para visualizar la EXTRACCIÓN DE DNA:

https://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ

Para visualizar la ELECTROFORESIS DE DNA:

https://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ
 Lección 2.2. Técnicas de secuenciación

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

Luis F. Pascual Calaforra

Departamento de Genética
Universitat de València
 La secuenciación del DNA
Secuenciación: Proceso mediante el cual se determina el orden preciso de las bases
nitrogenadas de una cadena de DNA.
La caracterización completa de un gen pasa por la determinación de su secuencia
nucleotídica y el posterior análisis funcional de la misma.

El primer ácido nucleico del que se obtuvo la

secuencia completa de sus 80 nucleótidos fue
el tRNAAla de S. cerevisiae, en el año 1965.

La irrupción de la incipiente tecnología del DNA

recombinante propició nuevas posibilidades para
abordar el reto y fue el método desarrollado por
Fred Sanger y su equipo, basado en la
polimerización del DNA y conocido como
secuenciación mediante didesoxinucleótidos
o método de Sanger
el que vino a convertirse durante muchos años en
procedimiento estándar para secuenciar cualquier
fragmento purificado de DNA.
El método enzimático de secuenciación de Sanger
Se basa en la síntesis enzimática de la cadena complementaria
a aquella que se quiere secuenciar.
Los elementos de la reacción enzimática de polimerización son:
(1) el DNA molde monocatenario a determinar clonado en un vector apropiado,
(2) un oligonucleótido que se empareje con éste y actúe de cebador,
(3) los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), uno de los cuales estará marcado y
(4) una DNA polimerasa.

Se preparan cuatro reacciones en

paralelo y a cada una se le añade un
2’,3’-didesoxinucleótido diferente
(ddNTP) (5).
El método enzimático de secuenciación de Sanger

El resultado es la obtención, en cada

reacción, de una mezcla de fragmentos de
distintas longitudes, producto del bloqueo
de la polimerización a nivel del último
nucleótido incorporado, un ddNTP concreto
que conocemos.

https://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html
 La secuenciación automática
Mejoras del método enzimático:
1. Utilizando nuevas polimerasas, más eficientes y de mayor procesividad: sequenasas.
2. Combinando la reacción de secuenciación con PCRs asimétricas.
3. Introduciendo fluorocromos di-
ferenciales acoplados a cada
uno de los terminadores.
4. Diseñando equipos que auto-
matizan el proceso.
 Secuenciación de fragmentos de gran tamaño o genomas
Las estrategias clásicas para el abordaje de este tipo de proyectos se basan esencialmente
en dos tipos de aproximaciones o en híbridos de ambas:
1, “Shotgun clon por clon” o “Shotgun jerárquico”.
Esta estrategia, también denominada “basada en mapas”, implica una fase de pre-secuenciación
en la que se identifican mediante marcadores moleculares y se ordenan un conjunto de clones
solapantes.
 Secuenciación de fragmentos de gran tamaño o genomas
Las estrategias clásicas para el abordaje de este tipo de proyectos se basan esencialmente
en dos tipos de aproximaciones o en híbridos de ambas:
2, “Shotgun aplicado al genoma completo”.
en este caso el genoma completo se fragmenta al azar, se clona y se secuencian los fragmentos.
Tecnologías de secuenciación masiva
Desde 2005 se vienen desarrollando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento,
conocidas como Next Generation Sequencing (NGS), o tecnologías de segunda generación,
que permiten obtener millones de bases en un corto periodo de tiempo.

Tamaño de lectura completa, en

gigabases, en función de la
longitud de lecturas individuales
para las diferentes plataformas de
secuenciación. Escala logarítmica.
Tecnologías de secuenciación masiva: Pirosecuenciación
En todas ellas los miles de reacciones de secuenciación tienen lugar en
una superficie muy reducida y los datos obtenidos a partir del análisis
de imágenes requieren un tratamiento informático adecuado.

La empresa Roche 454 Life Sciences fue la primera en comercializar uno de estos
sistemas. Su plataforma, GS-FLX-454, utiliza una serie de microesferas que portan distintos
fragmentos del DNA a secuenciar, cada esfera un fragmento que es amplificado por PCR.

https://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc&feature=fvw
Tecnologías de secuenciación masiva: Pirosecuenciación
Esta reacción se lleva a cabo por síntesis con detección luminiscente o pirosecuenciación.
Es una secuenciación en tiempo real, que va midiendo la liberación de pirofosfato (PPi)
durante la síntesis del DNA. El orden en que cada desoxirribonucleótido se va incorporando
se detecta a medida que la nueva cadena se va sintetizando, de manera que la secuencia
se puede "leer" según ocurre la reacción.
 Tecnologías de secuenciación masiva: Terminadores reversibles

La empresa Illumina, ha desarrollado la

plataforma Solexa que utiliza una estrategia
diferente basada en el uso de terminadores
reversibles.

Pasos de la reacción de secuenciación:

(1) Unión de los cebadores y de los primeros nucleótidos marcados.
(2) Lavado y excitación de los marcadores fluorescentes anotando los puntos donde hay
agrupaciones.
(3) Eliminación de terminadores y de marcadores fluorescentes.
(4) Nueva adición de nucleótidos.
Tecnologías de secuenciación masiva: Terminadores reversibles

Así, se secuencian de manera simultánea cientos

de miles de agrupamientos de secuencias de DNA
cada uno de ellos correspondiente a una secuencia
distinta, lo que permite obtener gran cantidad de
secuencias en un corto periodo de tiempo.
Secuenciador Illumina HiSeq 2500

https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
 Tecnologías de secuenciación masiva: Nanoporos y detección electrónica

El objetivo de las metodologías de secuenciación conocidas

como de tercera generación es la secuenciación de
moléculas únicas en tiempo real, sin que se requiera la
amplificación clonal de las moléculas individuales a secuenciar.

Oxford Nanopore Technologies ha desarrollado la

plataforma MinION basada en la secuenciación de
La astronauta estadounidense Kate Rubins con un
moléculas únicas mediante detección electrónica a secuenciador MinION en la ISS en agosto de 2016.
su paso por nanoporos.

Los nanoporos son agujeros de tamaño nanométrico (entre 1 y 100

nm) que pueden ser creados de manera sintética por proteínas en
forma de embudo o como huecos en materiales sintéticos.

Poro de alfa-hemolisina formado por siete subunidades (aparecen con

colores distintos) junto a una pequeña molécula de ADN de 12 nucleótidos
(color blanco). (Visión lateral y superior del poro).
Tecnologías de secuenciación masiva: Nanoporos y detección electrónica

Una enzima asociada a la proteína que forma el nanoporo guía al DNA hacia el mismo
y el tamaño del poro le obliga a atravesarlo base a base variando la magnitud de la
corriente de forma específica para cada base permitiendo así la lectura de la hebra.

El DNA atraviesa Lectura de la señal eléctrica Cada nucleótido tiene

el nanoporo causada por el bloqueo de una “firma” eléctrica
flujo de iones en el nanoporo específica
 El precio de secuenciar un genoma completo

Determinar con precisión el coste de la secuenciación de un genoma

dado (por ejemplo, un genoma humano) no es simple. Hay muchos
parámetros a definir y matices a considerar.

El precio de generar una secuencia de

genoma humano de alta calidad a mediados
de 2015 era de poco más de 4,000 dólares
mientras que a finales de 2015, la cifra
había caído por debajo de los 1,500.

En paralelo, el precio para generar una

secuencia de todo el exoma (conjunto de
exones del genoma) se estimó algo inferior
a 1,000 dólares.
 Lección 2.3. Genómica estructural

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

Rosario Gil
Departamento de Genética/
Instituto de Biología Integrativa de Sistemas
Universitat de València
Conocer el genoma

GENOMA: Dotación completa de material genético de un organismo.

El genoma almacena toda la información

biológica de un organismo.

La utilización de esa información depende una

compleja maquinaria bioquímica de expresión
genómica.

Un genoma es mucho más que un conjunto de genes

Conocer el genoma

En cuanto conocemos la secuencia de un genoma, los genes que contiene pueden ser
identificados y sus funciones pueden ser estudiadas con detalle

M A T E L
R A S NG C M R I
 De la genética a la genómica

Durante el siglo XX se avanzó en el conocimiento de la naturaleza y contenido del

material genético en cuatro fases:

1. Bases celulares de la herencia: los cromosomas

2. Bases moleculares de la herencia: la doble hélice

3. Mecanismos biológicos que permiten la transcripción y traducción, y desarrollo de la

Ingeniería Genética

4. Expansión de la Genómica: análisis de la información contenida en genomas completos

15 de febrero de 2001: Genoma humano

3.000 millones de nucleótidos
De la genética a la genómica

GENÓMICA: Estudio molecular del contenido, organización, función y evolución de la

información genética contenida en un genoma completo.

GENÓMICA ESTRUCTURAL: Secuenciación y análisis de la información contenida en el

genoma.

OBJETIVO: Cartografiar y determinar de forma completa y precisa la secuencia de

DNA del genoma haploide representativo de una determinada especie, indicando
la información que contiene.

Los estudios genómicos se caracterizan por ser interdisciplinares:

La enorme cantidad de datos generados requiere combinar tanto conocimientos

relativos a diversas disciplinas biológicas (genética, bioquímica, biología celular,
biología evolutiva…), como conocimientos estadísticos e informáticos.
La lógica de la secuenciación genómica

• El genoma se rompe en fragmentos pequeños cuya secuencia es determinada

individualmente (lecturas). Es la fase de secuenciación.

• Las lecturas se analizan con programas informáticos que encuentran secuencias

idénticas y permiten conectarlas en secuencias más largas o contigs. A este proceso se
le denomina ensamblaje.

• El objetivo final es conseguir que cada cromosoma se encuentre unido en un solo contig.
Molécula larga de DNA
fragmentación

secuenciación
Lecturas

Ensamblaje de
secuencias solapantes

Contig
(secuencia ensamblada)
 Secuenciación masiva

Las tecnologías de secuenciación masiva han abaratado

enormemente el coste de secuenciar un genoma
Los proyectos genoma

• Hemos pasado de secuenciar genomas modelo para una especie a secuenciar

decenas o cientos de cepas de una determinada especie.
• Disponemos de miles de genomas de nuestra especie que permiten conocer la
variabilidad existente en las distintas poblaciones humanas.
 Análisis de microbiomas: estudio de la biodiversidad

Muestra ambiental
Pacific Northwest National Lab

Extracción DNA

Amplificación rRNA 16S

• La gran mayoría de las especies microbianas que Secuenciación

viven en el planeta no han podido ser cultivadas, lo
que dificulta su estudio.
• Todos los seres vivos necesitan ribosomas para
fabricar sus proteínas.
• Estudiando el rRNA 16S podemos conocer las
bacterias presentes en comunidades complejas sin
necesidad de aislarlas previamente.
 Análisis de microbiomas: metagenómica

Muestra ambiental

Extracción DNA

• La secuenciación masiva de todo el Secuenciación masiva

material genético de la muestra nos
informa sobre las funciones que Similitudes con bases de datos de referencia
cada microorganismo realiza y las
interacciones entre los miembros Clasificación
Clasificación
de la microbiota taxonómica funcional
Referencias bibliográficas y enlaces

• Videos Youtube:
Whole Genome Sequencing and You
https://www.youtube.com/watch?v=IXamRS85hXU

• Páginas web:
Divulgación de las Ciencias Genómicas. UNAM.
www.divulgacion.ccg.unam.mx

1000 Genomes: A Deep Catalog of Human Genetic Variation.

http://www.1000genomes.org/

• Otros enlaces:
Understanding our microbial planet: the new science of metagenomics
http://dels.nas.edu/Materials/Booklets/Metagenomics-Booklet
 Lección 2.4. GENOMICA FUNCIONAL

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

José García Martínez

Departamento de Genética
Universitat de València
¿Qué es la Genómica Funcional?

La GENÓMICA es la rama de la genética que comprende el estudio del

contenido, organización, función y evolución de la información genética
contenida en un genoma completo

La GENÓMICA FUNCIONAL analiza la función de las secuencias determinadas

por la genómica estructural. Incluye el análisis del transcriptoma (conjunto
completo de RNAs transcritos a partir de un genoma) y del proteoma (conjunto
completo de proteínas codificadas por el genoma).

A diferencia de la genómica estructural (lección 2.3) y la proteómica, la genómica

funcional se centra en los aspectos dinámicos de los genes, como su
transcripción, la traducción, las interacciones DNA-proteína, RNA-proteína,
proteína-proteína…

La Proteómica ha adquirido tanto relieve que se ha erigido en una disciplina

independiente con un cuerpo de estudio muy voluminoso
Flujo de información genética

G. Estructural G. Funcional

3. Epigenómica 2. Interactómica 4. Fenómica

DNA RNA Proteína Metabolito

Fenotipo

1. Transcriptómica Proteómica Metabolómica

Biología de Sistemas Moleculares

Estrategias ómicas

Se dice de ellas que son meras “excursiones de pesca” y que no tienen una
hipótesis previa...(“guiadas por el experimento”)

 Sin embargo están produciendo una enorme cantidad de datos, sobre los
cuales se sustentan nuevas hipótesis y nuevos experimentos, tanto
convencionales como ómicos.
 Además no sesgan los resultados hacia nuestros deseos (“estrategias guiadas
por la hipótesis”)

Deben diseñarse correctamente para que produzcan resultados útiles y

estadísticamente contrastables. La interpretación de los resultados puede ser
más difícil que en los experimentos convencionales
1. Transcriptómica. Métodos de análisis de las expresión génica global

La transcriptómica estudia y compara transcriptomas, es decir, los conjuntos de

RNA mensajeros o transcriptos presentes en una célula, tejido u organismo

Métodos de análisis de la expresión génica múltiple (transcriptoma)

 Cuantificación:
 SAGE
 Chips de DNA (‘microarrays’)
 RNAseq

 Mapeo:
 Etiquetas 5’ CAGE y similares
 Etiquetas 5’ y 3’ PET
 Chips de embaldosado (‘tiling arrays’)
Aplicaciones de los estudios transcriptómicos

 Estudios de sensibilidad a drogas

 Comparación de fenotipos en función del patrón de expresión génica

 Establecer la estabilidad del mRNA a partir de datos de tasa de transcripción y

cantidad de mensajero, mediante la técnica de Genomic Run-On (GRO)

 Medidas directas de la estabilidad del mRNA mediante el método de la Parada

Transcripcional

 A partir del Análisis de Polisomas , podemos identificar el estado traduccional

de todos los mRNAs de la célula y podemos estimar la Tasa de Traducción. La
técnica del Ribosome Profiling nos permite además, establecer los sitios de
unión de los ribosomas en un momento dado

 Mediante el uso de arrays diseñados específicamente, también podemos

analizar simultáneamente el Splicing alternativo de cualquier organismo, o
también la existencia de transcritos antisentido.
2. Interactómica. Métodos de análisis de las interacciones a nivel genómico

La INTERACTÓMICA estudia el conjunto de interacciones entre distintas

biomoléculas en un entorno determinado. Estas interacciones tendrán en la mayoría
de los casos, funciones reguladoras. Con las técnicas a nivel ómico, podemos
analizar simultáneamente dichas interacciones a nivel de todo el genoma

Interacciones:
 Proteínas-DNA (e.g. Factores de transcripción): ChrIP-Chip, ChrIP-seq, ChrIP-exo,
ChiA-PET, Hi-C
 Proteínas-RNA (e.g. Regulones de estabilidad): RIP, CLIP
 RNA-RNA (e.g. iRNAs): CLASH
 Proteína-Proteína (e.g. proteínas diméricas)

Ch
ChrIP-Chip

RIP
3. Epigenómica. Métodos de análisis del fenotipo global

Aunque la posición de los nucleosomas, de factores de transcripción (TF), la

localización genómica de las modificaciones post-traduccionales y de las variantes de
las histonas, constituyen una parte de la interactómica, también forman parte de la
información genética transmisible que no es secuencia de DNA, es decir, epigenética
a escala ómica.

La otra información epigenética principal es la modificación química tanto del DNA

(metilación de citosinas, en las llamadas islas CpG) como de las histonas
(acetilación, metilación, fosforilación,…), que sabemos interviene en la regulación de
la expresión génica, activando o silenciando genes.

Detección de metilación de Citosinas en DNA genómico: Epigenoma

El método del tratamiento con bisulfito seguido de una

ultrasecuenciación permite localizar las citosinas que estaban
metiladas ya que después de la desaminación de las C con
bisulfite, la secuenciación permite distinguir las que estaban
metiladas que son leídas como C, de las que no lo estaban, que
ahora son leídas como U
4. Fenómica. Métodos de análisis del fenotipo global

Un fenoma es el conjunto de todos los fenotipos expresados por una célula, tejido,
órgano, organismo, o especie. La FENÓMICA sería el estudio de los fenomas, es
decir, el estudio de la naturaleza de los fenotipos y la forma en que se determinan, en
particular cuando se estudia en relación con el conjunto de todos los genes (genómica)
o todas las proteínas (proteómica).

Para ver el fenotipo que causa un gen, según el abordaje que hace por ejemplo el
análisis genético reverso, podemos provocar su mutación, eliminación o su inactivación y
ver el fenotipo que origina. Lo podemos hacer:
 Analizando una colección de mutantes de deleción
 Uso de promotores apagables
 Sistemas degrón
 iRNA
 Análisis sistemático de fenotipos sintéticos (SGA)
GENOMICA FUNCIONAL. Técnicas

 http://genome.cshlp.org/content/25/10/1427.full
 https://www.youtube.com/watch?v=uzINKcj-p78
 https://www.youtube.com/watch?v=4oFdS9EN9Pk
 https://www.youtube.com/watch?v=zwuUveGgmS0
 https://www.jove.com/video/3770/chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-
sequencing-chia
 https://www.youtube.com/watch?v=Gn20IFt5XWQ
 https://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE
 https://www.youtube.com/watch?v=wQoTxveTavw
 Lección 2.5. Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

Rosa Aznar Novella

Departamento de Microbiología y Ecología
Universitat de València
Fundamento de la PCR

Reacción enzimática de amplificación de ADN en la que interviene una polimerasa de ADN

termoestable, dos cebadores de secuencia complementaria al ADN diana, que delimitan el
tamaño del fragmento a copiar (amplicón), y desoxinucleótidos (dNTPs) como sustrato.

DNA
3’ 5’
5’ 3’ Pol dNTPs
Cebadores ADN Pol
ADN 3’ 5’
5’ 3’

Pasos del proceso:

1.- Desnaturalización 95 ºC
2.- Hibridación 50-60 ºC
3.- Extensión 72 ºC
Fases de la reacción y detección del amplicón

Al inicio de la reacción el amplicón aumenta de modo exponencial, pasando por una fase
lineal y finalmente alcanza la fase estacionaria o “plateau”.

En PCR convencional, la detección del producto de amplificación se realiza en la fase final,

por electroforesis en gel de agarosa, mediante tinción del ADN.
PCR convencional

• La detección es cualitativa
• Límite de detección 0,1 ng DNA
• Se confirma por tamaño, generalmente
• Se puede recuperar el fragmento del gel
para secuenciación
Fases de la reacción y detección del amplicón

En PCR a tiempo real, el amplicón generado es fluorescente y la detección se realiza

mediante una cámara CCD que capta la señal en cuanto se hace perceptible, en la fase
exponencial.

• La detección es en tiempo real

• Puede ser cuantitativa (qPCR),
referida a curva patrón
• Límite de detección < 0,01 ng DNA

PCR a tiempo real

qPCR
PCR a tiempo real

• Requiere de un sistema óptico integrado en el termociclador

• Marcado de los amplicones durante la amplificación
• Consiste en la monitorización de la fluorescencia emitida, a
lo largo del proceso de PCR

Ciclo umbral (CT): parámetro de cuantificación que

corresponde al inicio de la amplificación, y está directamente
relacionado con la cantidad de ADN molde inicial

Cuantificación: mediante
interpolación del valor de
CT en la curva estándar,
construida con muestras de
concentración conocida
(CO)
Marcaje de amplicones en PCR a tiempo real

Sistemas No específicos para generar la señal fluorescente, sonda química que

se une al DNA i.e. SYBR Green I: fluoróforo que unido al DNA emite
fluorescencia a 520 nm, cuando es excitado a λ 480 nm.
• La especificidad de la reacción depende de los cebadores
• La fluorescencia es reversible, al desnaturalizarse el ADN se libera el fluoróforo

Sistemas específicos para generar la señal fluorescente, sonda de ADN (oligonucleótido)

marcado con fluorocromo i.e. Sondas de hidrólisis “5’ nuclease assay” TaqMan
• Sonda marcada con fluoróforo (reporter) y silenciador (quencher), no emite fluorescencia
• Si encuentra la diana en el amplicón, la Taq polimerasa con actividad 5’-3’ exonucleasa
degrada la sonda, el fluoróforo emite fluorescencia
• Los más frecuentes:
Reporter FAM (6-carboxifluoresceína)
Quencher TAMRA (3-carboxi-tetrametil-rodamina)
Ventajas de la PCR como técnica

• Rapidez, en pocas horas se dispone del resultado

• Especificidad, determinada por la complementariedad de secuencia de los cebadores y
las condiciones de hibridación
• Sensibilidad, basta una única molécula de DNA molde para generar el amplicón

Aplicaciones

• Diagnóstico de enfermedades genéticas o infecciosas

• Detección de microorganismos patógenos en alimentos, aguas, muestras ambientales, etc.
• Detección de organismos manipulados genéticamente (OMG)
• Detección de alérgenos en alimentos (genes que codifican para la proteína alergénica o
secuencias universales del organismo que la produce)
• Cuantificación mediante qPCR
• Identificación de microorganismos
• Genotipado (i.e. perfil toxinas S. aureus, B. cereus)
PCR múltiple

• Amplificación simultánea de dos o más amplicones

• Tamaños de amplicones deben ser distintos, pero en el mismo rango
• Se han de optimizar las concentraciones de cebadores, Mg2+, dNTPs y DNA pol
• Establecer una T óptima promedio para las distintas parejas de cebadores
• Ahorra tiempo, trabajo y reduce el coste económico

PCR
convencional
Referencias bibliográficas y enlaces

Videos Youtube
PCR
https://youtu.be/Nl6eLez3CNI
https://youtu.be/iQsu3Kz9NYo

Electroforesis en gel de agarosa

https://youtu.be/NL1usCc0n38

qPCR, TaqMan
https://youtu.be/EaGH1eKfvC0

pPCR, SYBR green

https://youtu.be/CMHWR6l8IDY
 Lección 2.6. CRISPR

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

Sergi Maicas Prieto

Departamento de Microbiología y Ecología
Master en Biología Molecular, Celular y Genética
Universitat de València
¿Qué entendemos por CRISPR?

• Los CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) son

repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas
• Consisten en fragmentos de DNA con repeticiones cortas de secuencias de bases,
intercalados con pequeños fragmentos de "DNA espaciador" adquirido en
exposiciones previas a un virus
20 pb

Repeticiones Espaciadores
• 40% de las bacterias
• 90% de las arqueas
• Habitualmente asociados con los genes cas (nucleasas), como la Cas9

Operon Cas
Identificación bioinformática de CRISPR en genomas y metagenomas

• Hay programas que permiten localizar repeticiones de los interespaciados en

secuencias grandes de genoma y metagenoma
• CRT (CRISPR Recognition Tool)

• PILER-CR

• CRISPRfinder
¿Qué utilidad tiene CRISPR en un procariota (bacteria o arquea)?

• El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmune que confiere resistencia a agentes

externos como plásmidos y fagos; es una forma de inmunidad adquirida
• Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las
nucleasas Cas para cortar y degradar esos fragmentos de DNA extraños, de manera
similar al RNA de interferencia en eucariotas

Espaciadores
La nucleasa Cas9

• una enzima endonucleasa de DNA

de RNA guía asociada con un
sistema CRISPR

• memoriza e interroga al DNA foráneo

para comprobar si es complementario
a los 20 pb de la región del espaciador
del RNA guía

• Si el substrato de DNA es complementario al RNA guía, Cas9 se adhiere al DNA

invasor, y lo corta

• Se conocen otras nucleasas, como Cpf1, con un mecanismo de actuación diferente

Edición genética

• CRISPR-Cas9 son unas “tijeras moleculares” tienen la capacidad de alterar, borrar o

reorganizar el DNA de cualquier organismo vivo
• Es como hacer microcirugía de los genes para cambiar una secuencia de DNA con
facilidad y precisión en puntos concretos de un cromosoma.
• Usar un único RNA en conjunción con la proteína “cortadora”, la enzima Cas9, que
permite cortar cualquier secuencia de DNA que se desee
• Como se usa la misma proteína “cortadora” independientemente del gen diana, se pueden
diseñar experimentos en los que cambian varios genes en un organismo al mismo tiempo
usando Cas9 y múltiples RNA-guía
Hitos
• Primer artículo sobre CRISPR
(Ishino et al.) 2500
1987

• CRISPR están presentes en los 2000

2000 procariotas (Mojica et al.)

Citaciones
• Identificación espaciadores de
origen externo (mecanismo de 1500
2005 inmunidad adaptativa)

• Evidencia experimental de inmunidad 1000

2007 adaptativa (Barrangou et al.)

• CRISPR tipo II pueden expresarse 500

de manera heteróloga
2011 (Sapranauskas et al.)
0
• Ingeniería genética con Cas9 en 2002 2007 2012 2017
2013 células eucarióticas (Cong et al.)
Años

HOY
Citaciones en SCOPUS
Aplicaciones en numerosos organismos

• S. pneumoniae, E. coli (Jiang, Bikard et al.,2013, Nat. Biotechnol.)

• Células humanas (Le Cong et al., 2013, Science)

• Monos (Niu et al., 2014, Cell)

• Ranas (Blitz et al., 2013, Genetics)

• Pez Cebra (Hwang et al., 2013, Nature Biotechnol.)

• Insectos (Wang et al., 2013, Cell. Res.)

• Moscas (Gratz et al., 2013, Genetics)

• Plantas (Li et al., Shan et al., 2013, Nature Biotechnol.)

• Nematodos (Lo et al., 2013, Genetics)

• Levaduras (DiCarlo et al., 2013, NAR)

• Ganado (Tan et al., 2013, PNAS)

Aplicaciones

• Disrupción génica

• Gene knock-out (añadiendo un reporter)

• Introducción o corrección de SNP

• Etiquetado de genes

• Estudio de genes promotores (luciferasa)

• Knockout condicional

• Deleciones de cromosomas enteros

• Inserción de genes enteros

• CRISPR de interferencia (CRISPRi)

• CRISPR de activación (CRISPRa)

Aplicaciones (agricultura-alimentación)

• Inmunización artificial contra fagos por introducción de locus CRISPR en bacterias

industrialmente importantes, incluyendo a esas utilizadas en la producción de comida

y fermentaciones a gran escala

• Creación de una cepa de trigo resistente al oídio (hongo parásito de plantas, p.e. vid)

• Modificación de cultivos y animales de granja

• Ecosistemas (mosquitos transmisores de enfermedades)

Aplicaciones (biomedicina)

• Terapias génicas

• Tratamiento de enfermedades raras (mejorar la atrofia muscular en ratones afectados

por distrofia de Duchene)

• Corregir mutaciones causantes de la fibrosis quística

• Acabar con el virus de la Hepatitis B, malaria, …

• Conferir resistencia al virus del HIV

• Modelización del cáncer (posibilidad de alterar varios genes en un mismo ensayo y

de trabajar en modelos animales in vivo)

• Modificar células tumorales

• ¿Edición genómica de embriones?

Referencias bibliográficas y enlaces

Videos en youtube

- Sistemas CRISPR-Cas, una revolución biotecnológica con origen bacteriano”

Francisco M. Mojica https://www.youtube.com/watch?v=GOK6FkfmHdQ&t=120s
- “Genome Engineering with CRISPR-Cas9” Jennifer Doudna
https://www.youtube.com/watch?v=SuAxDVBt7kQ&t=18s

Otros enlaces:
- CRISPRCas9: Engineering a Revolution in Gene Editing
http://www.sciencemag.org/sites/default/files/custom-
publishing/documents/CRISPR-Cas9_booklet_HighRes.pdf
 Lección 2.7. MICROARRAYS

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 2. Técnicas en biología molecular (I)

José García Martínez

Departamento de Genética
Universitat de València
¿Qué es un microarray (o Chip de DNA)?

Una serie de sondas de DNA de longitud variable unidas a un soporte sólido en una
disposición regular y prefijada, sobre las que podemos hibridar una muestra
marcada

array columna

Sonda: DNA fijado al Chip

fila columna
Muestra: DNA/RNA marcado
Diana: cada uno de los componentes de la muestra
columna

fila
Cada sonda es representativa de un gen o un
transcrito (aunque un gen puede estar representado
por más de una sonda)
 Tipos de sondas

 DNA bicatenario: normalmente fragmentos de PCR de longitud variable

 Sondas de cDNA
 Oligonucleótidos: sintetizados in situ (fotolitografía) o in vitro y luego unidos al soporte
• Largos (10-100 nucleótidos)
• Cortos (< 40 nucleótidos)

Soportes para unión de las sondas

• Nylon con carga + para macroarrays

• Vidrio con grupos reactivos (polilisina

o grupos aldehído) para microarrays
• Cartuchos especiales para arrays de
oligonucleótidos (sintetizados in situ)
Imágenes de los diferentes arrays

Macroarrays de Nylon Microarrays de vidrio Oligo GeneChip®

(Affymetrix)
Etapas en el trabajo con los Chips de DNA

• Fabricación del array (o adquisición de un array comercial)

• Uso del Chip:

• Obtención y marcaje de la muestra
• Hibridación y lavados
• Lectura para la obtención de las imágenes de hibridación
• Cuantificación de las imágenes
• Normalización y análisis de los datos

Objetivo final:
 Detectar cambios entre dos muestras diferentes
 Cambios a nivel de DNA o bien cambios a nivel de mRNA

 Las muestras que pretendemos analizar deben estar marcadas de manera diferencial
(generalmente con fluoróforos diferentes, en el caso de los microarrays) o proceder de
hibridaciones diferentes (en el caso de los macroarrays o chips de oligonucleótidos)
 Muestra A
Muestra B

Sondas
(3 genes)

CHIP
Sondas
(3 genes)

CHIP
1 2 0
Result
0 1 1
 Usos de los microarrays de DNA

 Expresión: Cuantificar un conjunto de mRNAs o miRNAs de una muestra

 ChIP (Inmunoprecipitación de Cromatina): Identificar sitios de unión de proteínas a DNA

 Análisis de SNPs: Análisis de marcadores genéticos a gran escala

 CGH (Hibridación Genómica Comparada): Localización de reordenaciones cromosómicas

 Secuenciación: Identificación de la secuencia nucleotídica

TRANSCRIPTÓMICA: Análisis de la expresión génica global

Si la muestra que usamos es mRNA podemos evaluar las diferencias de expresión

génica (niveles de mRNA diferenciales) entre dos muestras diferentes (mutante/salvaje,
diferentes dosis de un tratamiento, cambios tras un estrés,…)

Cy3/Cy5
ADH1

ADH1
GENOMOTIPADO: Análisis de variaciones de secuencia (SNPs)
 GENOMOTIPADO: Análisis total o parcial del genoma

Si la muestra que usamos es DNA genómico, nos permite ver diferencias entre genomas, e
identificar deleciones y duplicaciones, y mapearlas incluso a nivel de gen

Extracción de DNA y digestión

Impresión

Test = DNA tumoral Referencia = DNA normal

marcado con marcado con

Software de análisis de imagen

Combinar cantidades
Sondas iguales de DNA

Hibridación escaneado

Pérdida de DNA tumoral Exceso de DNA tumoral

Deleción Amplifiación
imagen
Referencias bibliográficas y enlaces

• https://www.youtube.com/watch?v=3ZXq_aDfSB8
• https://www.youtube.com/watch?v=pWk_zBpKt_w
• https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
• https://www.youtube.com/watch?v=UgL1Pq2sk3M
• https://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM#t=25.062625
• https://www.youtube.com/watch?v=gfb8gYClc9Q
• https://www.youtube.com/watch?v=qC4RlnaA8fQ
 Lección 2.8. Citometría de flujo

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 3. Técnicas en biología molecular (I)

María Luisa Gil

Departamento de Microbiología y Ecología
Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnologia i Biomedicina
(ERI BIOTECMED)
Universitat de València
Fundamentos de la citometría de flujo

1. Generalidades. Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo

2. Principales sistemas y componentes de un citómetro de flujo

3. Tipo de información multiparamétrica obtenida:

• Directa: dispersión de la luz
• Indirecta: emisión de fluorescencia

4. Análisis de los datos

• Histogramas monoparametricos y biparametricos (dot-plots)
• Selección de poblaciones: ventanas o regiones
• Trabajando con multifluorescencia: solapamiento de espectros (compensación)

5. Separación celular por citometría de flujo

1. Generalidades

• La citometría de flujo es una tecnología que se utiliza con mucha frecuencia en

Inmunología y en el análisis de células sanguíneas o Hematología. Sin embargo, tiene
aplicaciones en otras muchas áreas como en Biología celular y molecular, Microbiología,
Toxicología, Farmacología, Biología de plantas, Biología marina, etc.

• Se utiliza, tanto en investigación básica como en el diagnóstico clínico.

• Nos da información multiparamétrica de cada célula individual dentro de una población

que puede ser heterogénea.

• La citometría de flujo detecta células individuales en suspensión, que son arrastradas

por un flujo de líquido que las hace desfilar una por una y de esta forma son iluminadas
por una fuente de luz.

• El citómetro recoge información de cada célula individual, basada en las propiedades de

dispersión de la luz de las células que se están analizando y también incluye la emisión
de fluorescencias si las células están marcadas con un fluorocromo.
1. Ventajas e inconvenientes

VENTAJAS
Análisis de un alto número de células en corto tiempo (5000-20000 eventos/segundo).
• Alta sensibilidad y objetividad. Nos da medidas cuantitativas: discriminación de células
según la cantidad de marcador
• Podemos medir múltiples parámetro de cada célula individual. Es decir, podemos
identificar una subpoblación minoritaria dentro de una población mayor heterogénea, sin
necesidad de separación previa.
• Además, si disponemos de un citómetro separador, también podemos purificar
subpoblaciones celulares.

INCONVENIENTES
• Poca información morfológica de la célula: incapacidad de visualizar las células que se
analizan.
• Necesita células individuales en suspensión
• Los equipos son caros y se necesita cierto entrenamiento y formación para manejarlos
 2. Principales sistemas y componentes

Un citometro de flujo es un sistema

combinado de:

Sistema de flujo: Transportar la muestra hacia el

haz de luz del láser y realizar la focalización
hidrodinámica que es la causa del paso
individualizado de ? En estas condiciones se
produce la intercepción entre el haz focalizado del
láser y la muestra, llamado punto de interrogación.

Sistema óptico: Iluminar las partículas de la muestra y

obtener las señales de luz resultantes en los filtros y
detectores (fotomultiplicadores) apropiados.

Sistema electrónico: Convertir las señales de luz (fotones) en

señales electrónicas (pulso electrico) que un programa de
cómputo puedan interpretar.
 3. Tipo de información obtenida

Detector de luz dispersada

lateral & complejidad celular
Medidas directas que nos dan
información sobre el tamaño
Fuente de
(FS) y la complejidad interna o Detector de luz Dispersada
luz incidente frontal & área de la
granularidad de la célula (SS) superficie celular

Medida de la fluorescencia
excitación
emitida, si las células están 575 785
marcadas con fluorocromos 488 emisión 575
FITC Cy7
sencillos (ejemplo FITC) o en
tándem (ejemplo PE Cy7)
488 PE
 4. Análisis de los datos

Histogramas monoparamétricos
(análisis de un parámetro)

Histogramas biparamétricos (dot-

plots) (análisis de dos parámetros)
4. Análisis de los datos

Selección de poblaciones: ventanas o regiones. Esto da una enorme potencia de análisis.

Ejemplo de identificación de células madre hematopoyéticas de ratón (población muy
minoritaria).
 4. Análisis de datos
FITC PE

Al trabajar con multifluorescencia (mas de un

fluorocromo simultáneamente), los espectros
de emisión pueden solaparse.
Compensación Calcula y elimina la
fluorescencia recogida en otros canales.

Los equipos actuales hacen las

compensaciones automaticas.

Los equipos más sofisticados pueden tener

PE
hasta 5 laser diferentes en la óptica de
excitación, y cada uno de ellos con varios FITC FITC
detectores asociados. Es decir, pueden
Control de compensación: marcas simples
detectar más de 20 fluorescencias de cada A: antes de compensar.
evento. B: después de compensar
5. Separación celular por citometría de flujo

Los citómetros separadores usan un principio basado en la

desviación electrostática de gotitas cargadas eléctricamente.
Las gotitas individuales (que contienen el
evento seleccionado) pueden cargarse
individualmente, de forma que pueden
llevar carga positiva, negativa o no llevar carga. A continuación
las gotitas pasan a través de un campo eléctrico estático creado
por dos placas cargadas. Las gotitas cargadas son atraídas por
la placa de carga contraria, y son desviadas a los tubos de
recogida.
La separación por citometría de flujo tienen grandes ventajas:
(i) da siempre mucha pureza, (ii) se puede seleccionar la
población a separar en base a múltiples parámetros (iii), se
pueden separar hasta cuatro subpoblaciones celulares
simultáneamente, con los equipos actuales.
Referencias bibliográficas y enlaces

http://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDrWo4&feature=related