BENEMÉRITA UNIVERSIDAD

AUTÓNOMA DE PUEBLA
Facultad de Ciencias Químicas
Centro de Química-Instituto de Ciencias
Posgrado en Ciencias Químicas

Evaluación de la expresión de Galectina-4 en

suero y tejido de pacientes con cáncer
cervicouterino e identificación de su ARNm en
células de cérvix

Tesis presentada pata obtener el grado de

DOCTORADO

Presenta
M. C. Ileana Conde Rodríguez

Directores de tesis
D. C. José Gustavo López y López
D. C. Verónica Vallejo Ruiz

PUEBLA, PUEBLA JULIO 2021

Dedicado a mi padre con amor eterno
C.P. José R. Conde Cualla
Quien me dejó demasiado pronto
“Las grandes mentalidades tienen sus fines, mientras que las menos enaltecidas solo
tienen deseos. Esas mentalidades timoratas siempre están sujetas a experimentar
desgracias, mientras que las elevadas y nobles las eluden”

Una finalidad dominante en nuestra mente nos hace avanzar hacia adelante. Es la
finalidad de la vida. Pero ¿cómo podríamos vivirla sin derramar sobre el mundo lo
mejor de nuestras habilidades, de nuestras virtudes y de nuestros afectos? Si vamos a
mantener simples deseos de ganancia personal, o de propia satisfacción, no solo
empobrecemos nuestras vidas, sino que frustramos la Ley Divina.

Debemos ser felices, Emilio Gocker

 Agradecimientos

FINANCIMIENTO CONACYT

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

Proyecto CONACYT Infraestructura No. 300379

No. De Becario 553529

FINANCIAMIENTO IMSS

El proyecto fue financiado por el Instituto Mexicano del Seguro

Social FIS/IMSS/PROT/G17-2/1760

No. de Becario 98227566

El proyecto se desarrolló en el laboratorio de Biología Molecular del

Centro de Investigación Biomédica de Oriente-IMSS

Especial agradecimiento a los honorables miembros de comisión

revisora por el tiempo invertido en la revisión de esta tesis
 Agradecimientos
Existe una lista larga de las personas que han estado como parte de mi formación
profesional, pero aún más, las que me han acompañado en mi vida personal. A pesar de los
cambios y del tiempo han estado a mi lado.

Puedo empezar por agradecer a mi familia, que siempre han sido un escalón firme en mi
camino. Mi padre José, que con su vida y con su muerte me ha enseñado fortaleza,
perseverancia y un propósito en cada día, además de su infinito amor. Mi madre Ofelia que
es una mujer de carácter fuerte y gran corazón, siempre con mimos y algún regaño cuida
de mí. Mis hermanos Fer y Luis que son la alegría de mi vida y han hecho este camino más
y más llevadero. Mi amado esposo Luis que ha sido mi soporte, mi amigo, mi confidente de
lágrimas y quien siempre cree en mí, incluso cuando yo misma me he perdido la fe.

Dra. Vero que con los años se ha convertido en una amiga y por supuesto mi tutora, hemos
vivido muchas cosas juntas y siempre me ha mostrado ser una mujer fuerte e inteligente.

Dr. Gustavo que me conoció en la maestría y me abrigo en el doctorado. Gracias por el

apoyo, por formarme como una profesionista completa y capaz de andar sola en el camino.

Q. Tony que me vio crecer, gracias por estar a mi lado y las largas platicas de la vida, por
ser una amiga.

Dra. Lupita, por el tiempo invertido en mi formación y su disposición, por todos los
conocimientos que me compartió.

A mis compañeros de laboratorio con los que tuve la oportunidad de convivir, tengo de
cada uno un recuerdo especial. Las largas horas de trabajo, cuando llegábamos al salir el
sol y a veces volvíamos con la noche. Las pláticas y una que otra cerveza para relajarnos y
también las travesuras.

Gracias a Jocelyn, Lupita, Ivonne, Denisse, Liliana siempre fueron un soporte, me brindaron
aliento para continuar, cariño, comprensión, compasión y bondad. Gracias por su amistad
sincera y por quedarse conmigo en los momentos difíciles que tuve que sopesar, a pesar
de la distancia y las circunstancias están a mi lado. Gracias por siempre creer en mí y por
las anvorguesitas.
 ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1
1.1. Epidemiologia del cáncer cervicouterino ............................................................................ 1
1.2. Factores de riesgo ................................................................................................................ 3
1.2.1. Infecciones y cáncer cervicouterino ............................................................................ 3
1.2.2. Comportamiento sexual y cáncer cervicouterino ........................................................ 5
1.2.3. Uso de anticonceptivos orales y el riesgo de desarrollar cáncer cervicouterino ......... 6
1.2.4. Tabaquismo y cáncer cervicouterino ........................................................................... 6
1.3. Anatomía del cuello uterino ................................................................................................ 6
1.3.1. Tipos epiteliales del cuello uterino.............................................................................. 8
1.3.2. Unión escamo-columnar ............................................................................................. 9
1.4. Detección temprana de cáncer cervicouterino................................................................... 10
1.4.1. Detección y tratamiento de las lesiones premalignas ................................................ 11
1.5. Diagnóstico clínico y estadificación de cáncer cervicouterino ......................................... 13
1.5.1. Biomarcadores en cáncer cervicouterino .................................................................. 16
1.6. Galectinas .......................................................................................................................... 18
1.6.1. Generalidades de las galectinas ................................................................................. 18
1.6.2. Mecanismo de secreción de las galectinas ................................................................ 19
1.6.3. Localización subcelular y unión a ligandos .............................................................. 20
1.6.4. Funciones celulares de las galectinas ........................................................................ 20
1.6.5. Expresión de galectinas en tejidos............................................................................. 21
1.6.5.1. Galectinas y el desarrollo de cáncer .......................................................................... 22
1.6.6. Galectinas séricas como biomarcadores en enfermedades ........................................ 24
1.6.6.1. Galectinas séricas en cáncer ...................................................................................... 24
1.7. La participación de la galectina-4 en las funciones celulares y el cáncer ......................... 27
1.7.1. Características generales ........................................................................................... 27
1.7.2. Mecanismo de secreción y exporte de la galectina-4 ................................................ 29
1.7.3. Expresión de galectina-4 en tejido humano .............................................................. 30
1.7.4. Funciones biológicas de galectina-4.......................................................................... 30
1.7.5. La desregulación de la expresión de galectina-4 y cambios asociados al desarrollo de
cáncer 31
1.7.6. Cambios de expresión de galectina-4 en tejido y su asociación con el desarrollo de
cáncer 33
 1.7.7. Incremento de galectina-4 sérica en cáncer ............................................................... 34
2. JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................. 36
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................. 36
4. HIPÓTESIS ........................................................................................................................... 37
5. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 37
5.1. Objetivo General ............................................................................................................... 37
5.2. Objetivos Específicos ........................................................................................................ 37
6. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 38
6.1. Población en estudio.......................................................................................................... 38
6.2. Determinación de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes......................... 38
6.3. Evaluación de la proteína galectina-4 en tejido cervical ................................................... 39
6.4. Localización de la galectina-4 en tejido cervical por inmunofluorescencia ...................... 40
6.5. Características de las líneas celulares y su mantenimiento ............................................... 41
6.6. Cuantificación de la expresión del gen LGALS4 en líneas celulares por PCR en tiempo real
42
6.7. Cuantificación de la proteína galectina-4 en líneas celulares por Western Blot ............... 43
6.8. Evaluación de la expresión y localización de la galectina-4 en líneas celulares por
inmunofluorescencia ..................................................................................................................... 44
6.9. Análisis estadístico ............................................................................................................ 45
7. RESULTADOS ..................................................................................................................... 47
7.1. Características de la población de estudio ......................................................................... 47
7.1.1. Características sociodemográficas de las pacientes con cáncer con procesamiento de
galectina-4 sérica.......................................................................................................................... 47
7.1.2. Características de las pacientes a las que se evaluó la expresión en tejido de galectina-
4 49
7.2. Concentración de galectina-4 en suero de pacientes con cáncer cervicouterino ............... 51
7.2.1. Análisis de la concentración de galectina-4 sérica y las características clínico-
patológicas en pacientes con cáncer cervicouterino ..................................................................... 52
7.2.2. Galectina-4 sérica como marcador diagnóstico en pacientes con cáncer cervicouterino
55
7.3. Expresión de galectina-4 en tejido de pacientes con cáncer cervicouterino...................... 57
7.3.1. Expresión de galectina-4 en epitelio escamoso ......................................................... 57
7.3.2. Expresión de galectina-4 en epitelio columnar. ........................................................ 62
7.3.3. Evaluación de la localización de galectina-4 en tejido cervical por
inmunofluorescencia .................................................................................................................... 63
7.4. Concentración sérica de galectina-4 y la relación con su nivel de expresión en tejido de
pacientes con cáncer cervicouterino ............................................................................................. 66
 7.5. Niveles de expresión del gen LGALS4 y proteína en líneas celulares de cérvix ............... 67
7.5.1. Cuantificación de la expresión del gen LGALS4 en líneas celulares........................ 67
7.5.2. Evaluación de la expresión de la proteína galectina-4 en líneas celulares. ............... 68
7.5.3. Localización de galectina-4 en líneas celulares......................................................... 70
8. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 71
9. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 77
10. PERSPECTIVAS .................................................................................................................. 78
11. REFERENCIAS .................................................................................................................... 79
ANEXO I: Preparación de soluciones y material .............................................................................. 93
Preparación de laminillas para histoquímica ................................................................................ 93
Buffer de citratos 10 mM, pH 6 ................................................................................................... 93
PBS pH 7.2-7.4 ............................................................................................................................ 93
BSA 1% 93
BSA 5% 93
Triton X-100 2% .......................................................................................................................... 93
Poliacrilamida 30% ...................................................................................................................... 94
Persulfato de amonio 10% ........................................................................................................... 94
Dodecilsulfato de sodio (SDS) 10% ............................................................................................ 94
Tris base 0.5 M pH 6.8 ................................................................................................................. 94
Tris base 1.5 M pH 8.0 ................................................................................................................. 94
Buffer Laemmli ............................................................................................................................ 94
Buffer de transferencia 0.06% pH 8.3-8.5 ................................................................................... 94
Solución de lavado TBS y TBS-T ................................................................................................ 95
Buffer de carga para proteínas ..................................................................................................... 95
Buffer Stripping ........................................................................................................................... 95
RIPA 95
Preparación de gel de poliacrilamida ........................................................................................... 96
ANEXO II: Consentimiento informado ............................................................................................ 97
ANEXO III: Publicación y congresos ............................................................................................. 102
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estimación de incidencia, mortalidad y prevalencia del CaCu en países de Latinoamérica

y el Caribe. México se posiciona en el segundo lugar de incidencia, mortalidad y prevalencia en la
población femenina de 0 a 74 años [3]. ............................................................................................... 1
Figura 2. Estimación de incidencia, mortalidad y prevalencia por CaCu en países de Latinoamérica
y el Caribe. En México el CaCu se posiciona en el segundo lugar de incidencia, mortalidad y
prevalencia en la población femenina. [3]........................................................................................... 2
Figura 3. Anatomía del aparato reproductor femenino. Se divide principalmente en tres partes,
útero, cérvix y vagina. El cérvix está conformado por endocérvix y exocérvix, en la parte superior
está delimitado por el orificio interno que conecta con el útero y en la parte inferior con el orificio
externo conectando con la vagina. Creado con BioRender.com. ........................................................ 7
Figura 4. Epitelio escamoso, columnar y unión escamocolumnar. Creado con BioRender.com. ....... 9
Figura 5. Representación esquemática de la región promotora del gen LGALS4. Se presentan los
sitios putativos de unión a factores de transcripción. Imagen modificada de Huflejt &Leffler 2004.
........................................................................................................................................................... 27
Figura 6. Representación esquemática de los dominios de reconocimiento de Gal-4. Ambos
dominios se componen de dos láminas antiparalelas, cada lámina está formada por seis hebras
antiparalelas....................................................................................................................................... 28
Figura 7. La concentración de Gal-4 sérica en mujeres con citología normal y mujeres con CaCu. Se
muestra la concentración de Gal-4 (pg/ml) en suero de pacientes control ( n= 13), y con CaCu (
n= 39). Análisis de Mann-Whitney ** p=0.0061. ............................................................................. 51
Figura 8. Niveles séricos de Gal-4 en pacientes con CaCu por tipo histológico p=0.0949. ............. 53
Figura 9. Niveles séricos de Gal-4 por estadio clínico p=0.1997...................................................... 53
Figura 10. Niveles séricos de Gal-4 con respecto al tamaño de tumor p=0.1325. ............................ 54
Figura 11. Curva ROC de la concentración sérica de Gal-4 de pacientes con CaCu. La gráfica
muestra un área bajo la curva de 0.7515, p=0.0071, 0.5900 a 0.9129 de 95% de intervalo de
confianza, error estándar de 0.0823. ................................................................................................. 56
Figura 12. Inmonudetección de Gal-4 en epitelio escamoso de tejido normal y con CaCu. En el
epitelio normal (A y B) la expresión de Gal-4 se encontró en el citoplasma de las células, mientras
que en tejido tumoral (C y D) la expresión de Gal-4 se encontró tanto en citoplasma como en
núcleo. Las fotos se tomaron en una amplificación de 20X y 40X. .................................................. 58
Figura 13. Expresión de Gal-4 en tejidos respecto a queratinización. Expresión de Gal-4 en tumores
queratinizantes ( n=16) y no queratinizantes (■ n=5). Los niveles de expresión de Gal-4 en
tumores fue mayor que en los que no presentan queratina, La media de la intensidad de la expresión
de Gal-4 fue calculada con el programa Image-Pro. Análisis Mann-Whitney * p=0.0318. ............. 60
Figura 14. Expresión de Gal-4 respecto a estadio FIGO. Se muestra la expresión de Gal-4 en
tumores de pacientes con estadios FIGO I-II (● n=16) y III-IV (■ n=9). En estadios tempranos (I-II)
se observó un menor nivel de expresión de Gal-4, con respecto a los estadios tardíos (III-IV). La
media de intensidad de coloración en las biopsias se obtuvo con el programa Image-Pro. El análisis
Mann-Whitney no mostró diferencias significativas (p=0.1868). ..................................................... 60
Figura 15. Expresión de Gal-4 en tumores de pacientes con CCE de cérvix en diferentes estadios.
La expresión de la Gal-4 se muestra en células epiteliales de tumores de pacientes con diferentes
estadios, tanto en citoplasma como en núcleo, observando un nivel de expresión alto en algunas
células tumorales. El análisis estadístico no mostró una relación entre la intensidad de coloración
con el estadio clínico. ........................................................................................................................ 61
Figura 16. Inmunodetección de Gal-4 en epitelio columnar de muestras normales y con CaCu. Se
muestra el epitelio columnar normal (A y B) y con CaCu (C y D). Se encontró que epitelios
columnares normales tienen una baja expresión de Gal-4 a diferencia de los adenocarcinomas. En
los tejidos de adenocarcinoma se observó principalmente en las células columnares. ..................... 62
Figura 17. Detección de Gal-4 por inmunofluorescencia en tejido de cérvix normal. La expresión de
Gal-4 se muestra en color verde (Alexa Fluor 488) y los núcleos en color azul (DAPI). Figura A y
D, se muestra la tinción de núcleos en aumento 10X y 20X. Figuras B y E se muestra la tinción de
Gal-4 a un aumento de 10X y 20X. En las figuras C y F se muestra el merge de ambas señales. .... 63
Figura 18. Localización de Gal-4 en el epitelio de un tejido con diagnóstico de CaCu. La expresión
de Gal-4 se muestra en color verde y la tinción nuclear en color azul. Figuras A y D, se muestra la
tinción de núcleos en aumento 10X y 20X. Figuras B y E se muestra la tinción de Gal-4 a un
aumento de 10X y 20X. En las figuras C y F se muestra el merge de ambas señales....................... 64
Figura 19. Localización de Gal-4 en un epitelio con características de una lesión escamosa
intraepitelial de un tejido con diagnóstico de CaCu. La expresión de Gal-4 se muestra en color
verde y los núcleos en color azul. Figuras A y D, se muestra la tinción de núcleos en aumento 10X y
20X. Figuras B y E se muestra la tinción de Gal-4 a un aumento de 10X y 20X. En las figuras C y F
se muestra el merge de ambas señales. ............................................................................................. 65
Figura 20. Gal-4 en suero y tejido de pacientes. En el nivel de expresión en tejido se muestra con la
densidad media de los niveles séricos, se muestran con la correlación de Spearman r, p=0.4918. .. 66
Figura 21. Niveles de expresión del gen LGALS4 en diferentes líneas celulares. La expresión fue
analizada mediante PCR tiempo real, los niveles de expresión del gen LGALS4 fueron
normalizados con el gen endógeno hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT), la
expresión relativa fue obtenida empleando el método ∆∆Ct. ANOVA de una vía con un post-
análisis de Dunnet, * p<0.05, **** p<0.001 ..................................................................................... 67
Figura 22. Detección de Gal-4 en líneas celulares de cérvix. Se realizó Gal-4 mediante un western
blot en líneas celulares SiHa y HaCat, como control positivo se usó yeyuno de rata. Como control
de carga se usó un anticuerpo anti- -actina. .................................................................................... 68
Figura 23. Identificación de la expresión de la Gal-4 en líneas celulares A. Nivel de expresión de
Gal-4 en las células HaCaT, SiHa y Jurkat. Se muestran los resultados del análisis densitométrico
de las bandas de Gal-4 normalizadas con respecto a β-actina B. Ensayo de WB que muestra la
detección de Gal-4 en líneas celulares mencionadas, para el ensayo fueron usados 100 µg de
proteína total para cada tipo celular. Se hizo un análisis de ANOVA de una vía con un post análisis
de Dunn´s, n=4. ................................................................................................................................. 69
Figura 24. Localización de Gal-4 en líneas celulares. En el panel se ejemplifica la expresión de Gal-
4 en HaCat (control) y SiHa (CCE), en A y D se observa la tinción nuclear (DAPI), en B y E la
expresión de Gal-4 y en C y F el merge de ambas señales. En las microfotografías se muestra la
expresión de Gal-4 en color verde y la tinción nuclar en color azul, las imágenes de tomaron con un
objetivo de 63X de inmersión ........................................................................................................... 70
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Equivalencia de terminología entre displasia, NIC y el Sistema Bethesda ......................... 12

Tabla 2. Estadificación FIGO para CaCu [58]. ................................................................................. 14
Tabla 3. Clasificación TNM para CaCu y FIGO [61] ...................................................................... 15
Tabla 4. Características de las líneas celulares.................................................................................. 41
Tabla 5. Secuencia de oligonucleótidos y su tamaño de amplificación ............................................ 43
Tabla 6. Características sociodemográficas y ginecológicas de las pacientes con CaCu y suero
procesado........................................................................................................................................... 48
Tabla 7 Características de las pacientes con CaCu y estudio en biopsia........................................... 49
Tabla 8. Niveles séricos de Gal-4 y características clínico-patológicas. ........................................... 52
Tabla 9. Niveles séricos de Gal-4 en pacientes con carcinoma escamoso y características clínico-
patológicas......................................................................................................................................... 55
Tabla 10. Nivel de expresión de Gal-4 en tejido y características clínico-patológicas de pacientes
con CaCu ........................................................................................................................................... 59
Tabla 11. Nivel de expresión de Gal-4 en suero y tejido de pacientes con CaCu ............................. 66
 RESUMEN
El cáncer cervicouterino (CaCu) es la segunda causa de muerte en mujeres mexicanas, aunque
existen programas de prevención, la incidencia y nuevos casos van en aumento. Galectina-4 (Gal-
4) es una proteína que presenta una expresión alterada en diferentes tipos de cáncer, estos
cambios se han asociado a recurrencia temprana y metástasis lo que conlleva a un mal pronóstico.
En el CaCu, no se ha estudiado la Gal-4. El objetivo del estudio fue determinar el nivel de
expresión y localización subcelular de Gal-4 en tejido CaCu y la concentración en suero de
pacientes con CaCu. Así como caracterizar la expresión de Gal-4 en líneas celulares cervicales.

La determinación de Gal-4 sérica se realizó con un ELISA. Para evaluar la expresión en tejido
cervical, se realizó tinción inmunohistoquímica. Para analizar los niveles de expresión del gen
LGALS4 en las líneas celulares se realizó un PCR en tiempo real, para la identificación de la
proteína Gal-4 se realizaron ensayos de Western Blot e inmunocitoquímica.

Los resultados mostraron que la concentración de Gal-4 en el suero de pacientes con CaCu era
mayor (647.9 pg/ml) que en el suero de mujeres con citología normal (382.1 pg/ml). Por otro
lado, el análisis inmunohistoquímico de las muestras de CaCu mostró una mayor expresión de la
proteína en los tumores queratinizantes con respecto a los no queratinizantes y una tendencia de
mayor expresión en los tumores de pacientes con estadio clínico avanzado. Con respecto a su
localización celular, en tejido cervical normal, la Gal-4 se detectó en el citoplasma, y en las
células tumorales de carcinoma escamoso y adenocarcinoma, la presencia de Gal-4 se detectó
tanto en el citoplasma como en el núcleo. El aumento de la concentración sérica y la localización
diferente en las células tumorales sugieren un posible papel de la Gal-4 en el desarrollo de CaCu.
Mediante un análisis ROC se determinó que Gal-4 sérica es un prometedor biomarcador para
diagnóstico.

La línea celular SiHa fue la que presentó mayor expresión respecto a los controles HaCat y Jurkat.
La proteína fue detectada en la línea celular SiHa, el análisis inmunocitoquímico mostró que la
mayor expresión de Gal-4 se localiza en el núcleo a comparación de las células control HaCat
que expresan principalmente en el citoplasma. Este cambio de localización podría asociarse con
características más agresivas, aunque serán necesarios estudios funcionales.
 ABSTRACT
Cervical cancer (CC) is the second leading cause of death in Mexican women, although there are
prevention programs, the incidence and new cases are increasing. Galectin-4 (Gal-4) is a protein with
altered expression in different types of cancer. These changes have been associated with early
recurrence and metastasis, which result in poor prognosis.

Gal-4 has not been studied in CC. The objective of this study was to determine the levels of expression
and subcellular localization of Gal-4 in tissue and serum levels of patients with CC. As well as
characterizing the Gal-4 expression in cervical cell lines.

The determination of Gal-4 in serum was made with ELISA. To evaluate the expression in cervical
tissue, an immunohistochemical staining was performed. To analyze the expression levels of LGALS4
gene in cell lines, a real time PCR was performed. To identify the Gal-4 protein Western Blot and
immunocytochemistry assays were performed.

The results showed that the serum Gal-4 concentration of patients with CC was higher (647.9 pg/ml)
than that in the serum of women with normal cytology (382.1 pg/ml). The immunohistochemical
analysis of the CC samples showed a higher expression of the protein in keratinizing tumors compared
to non-keratinizing tumors and a trend of higher expression in tumors from patients with advanced
clinical stage. About the Gal-4 cellular localization in CC samples, it was detected in the cytoplasm
in normal tissues, while in tumor cells of squamous carcinoma and adenocarcinoma, Gal-4 was
detected both in the cytoplasm and nucleus. A ROC analysis of serum Gal-4 showed that it is a
promising diagnostic biomarker. The increased levels and the different localization in tumoral cells
suggest a possible role of Gal-4 in CC development.

The SiHa cell line had the highest expression compared to the HaCat and Jurkat controls. The protein
expression was detected in SiHa, the immunochemistry showed that the highest Gal-4 expression is
in the nucleus compared to HaCat cells, where it was found mainly in the cytoplasm. This localization
change could be associated with more aggressive characteristics, although functional studies will be
necessary.
 1. INTRODUCCIÓN
El cáncer cervicouterino (CaCu) es una alteración celular que se origina en el epitelio del
cérvix que se manifiesta inicialmente a través de lesiones precursoras de lenta y progresiva
evolución, las cuales progresan a un cáncer in situ o un cáncer invasor en donde las células
con transformación maligna traspasan la membrana basal. El CaCu es considerado un
problema de salud pública que se presenta principalmente en la población de nivel
socioeconómico bajo y en países con bajos ingresos. Existen varios programas de detección
de la enfermedad pre-invasora, sin embargo, los diagnósticos por lo general se realizan
cuando el estadio está avanzado y por lo tanto deriva a un mal pronóstico.

1.1.Epidemiologia del cáncer cervicouterino

El CaCu es el cuarto tipo más común en la población femenina a nivel mundial, en 2018 se
estimaron más de 570,000 casos y 311,000 muertes [1, 2].

Figura 1. Estimación de incidencia, mortalidad y prevalencia del CaCu en países de Latinoamérica y el

Caribe. México se posiciona en el segundo lugar de incidencia, mortalidad y prevalencia en la población
femenina de 0 a 74 años [3].

1
En los países de Latinoamérica y el Caribe, México ocupa el segundo lugar en incidencia,
mortalidad y prevalencia, superado por Brasil que se sitúa en el primero [3] (Figura 1).

En México el CaCu se encuentra en el segundo lugar de incidencia, mortalidad y prevalencia,

[3, 4]. En 2018 se estimó una incidencia de 57 000 casos, 26 000 muertes y una prevalencia
de 42,000 (Figura 2) que representa una tasa de incidencia estandarizada por edad de 22.6 y
una tasa estandarizada por edad de 10.5 casos (por cada 100,000 por año) [3].

Figura 2. Estimación de incidencia, mortalidad y prevalencia por CaCu en países de Latinoamérica y el

Caribe. En México el CaCu se posiciona en el segundo lugar de incidencia, mortalidad y prevalencia en la
población femenina. [3].

En el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en el año 2000 se reportó una tasa de
mortalidad por CaCu de 13.3 muertes por 100, 000, en 2011 de 5.3 por cada 100, 000 mujeres
[5] y en 2018 la tasa de mortalidad fue de 4.4 por cada 100, 000 mujeres [6]. La disminución
de los casos en los últimos años, es atribuida a los programas de prevención y detección
temprana, el IMSS invierte más de 75,787 millones de pesos para la detección y tratamiento

2
de CaCu [6]. Los datos estadísticos mostrados, indican que el CaCu es un problema de salud
pública en México y que debe atenderse por los sistemas de salud, además debe fomentar la
investigación básica y clínica, a fin de que se implementen nuevas estrategias para la
detección temprana y seguimiento de la respuesta a tratamiento.

1.2.Factores de riesgo

El desarrollo de CaCu está asociado al estatus socioeconómico, el 85% de los casos se

presenta en los países con bajos ingresos [7] y con un índice de desarrollo humano bajo (HDI,
Human Development Index) [1]. La incidencia más alta se encuentra en América Central y
del Sur, Asia y África [7]. Otros factores que se han vinculado con el desarrollo de CaCu son
las infecciones persistentes por algunos genotipos de VPH, el comportamiento sexual que
está relacionado con el número de parejas sexuales, el número de partos, el uso de
anticonceptivos, las infecciones vaginales como la clamidia y herpes, el tabaquismo, el estado
del sistema inmunológico, la infección por VIH y el consumo de dietilestilbestrol (DES) [8].
A continuación, se describen algunos de estos factores de riesgo.

1.2.1. Infecciones y cáncer cervicouterino

Algunas de las infecciones que se transmiten por contacto sexual se han clasificado como
factores de riesgo para desarrollar CaCu como la clamidia, el herpes y el VPH. Estas
infecciones modifican la estructura epitelial y la respuesta del sistema inmunológico,
predisponiendo a que las pacientes desarrollen CaCu, además algunas co-infecciones con
VPH se encuentran presentes.

1.2.1.1. Infecciones vaginales y cáncer cervicouterino

La clamidia es una patología causada por la bacteria Chlamydia trachomatis, frecuentemente

es asintomática, esta infección ocasiona cervicitis, hipertrofia e inflamación prolongada, esto
predispone a que otras patógenos como el VPH infecten el epitelio, debido al daño en la
integridad del epitelio de la zona de transformación [9, 10].

3
La infección de C. trachomatis se ha identificado como un factor de riesgo para desarrollar
CaCu [10, 11], mujeres con infecciones de C. trachomatis presentaron un mayor riesgo de
desarrollar carcinoma de células escamosas cervicales, aunque para adenocarcinoma el
riesgo fue menor [10, 11]. Las pacientes que presentan infección por C. trachomatis y que
son positivas a VPH-16 tienen un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad respecto a los
controles [10]. Se desconoce el mecanismo biológico por el que esta bacteria incrementa el
riesgo de desarrollar CaCu, pero uno probable, es la producción de especies reactivas de
oxígeno (EROs), el incremento de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento,
disminución de la inmunidad celular, que en conjunto ocasionan daños al ADN y alteran la
reparación del mismo [11].

El herpes es ocasionado por la infección con el virus del herpes simple (VHS), este virus se
ha asociado al desarrollo de CaCu[12], además se encontró que la carga viral del VHS-2
incrementó desde la cervicitis (inflamación del cuello uterino) hasta las lesiones y carcinoma
de células escamosas (CCE) y adenocarcinoma (AC) [13]. La co-infección de VHS-2 y VPH
podría tener una asociación con el desarrollo de CaCu [14], este tipo de infección es aún
controvertida, ya que algunos autores no han encontrado el virus en muestras de CaCu[15],
sin embargo, esto puede atribuirse al método de detección utilizado [16].

1.2.1.2. Infecciones persistentes de VPH y el cáncer cervicouterino

El VPH es el principal agente etiológico del CaCu, del 95 al 99 % de los casos de cáncer
presentan infecciones persistentes por VPH oncogénicos [17-20]. Los VPH son capaces de
infectar tejido cutáneo o mucosas, aproximadamente 40 genotipos tienen tropismo por
mucosas anogenitales [21]. Estos virus se clasifican de acuerdo con su capacidad oncogénica
en genotipos de alto y bajo riesgo [22]. A nivel mundial los VPH de alto y bajo riesgo con
mayor prevalencia son -16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56 y -58 [22, 23] y -6, -11,
-40, -42, -43, -44, -54, -61, -70, -72, -81 y -CP6108 [22] respectivamente.

Se estima que aproximadamente el 40% de las mujeres tienen al menos una infección anual,
esta infección puede tener una duración de 8-10 meses, alrededor del 90% de las mujeres
infectadas es capaz de resolver la infección por sí misma [24], mientras que el 10 % restante
presentan infecciones persistentes. La prevalencia de VPH de alto riesgo es un factor

4
determinante para la progresión, mantenimiento y desarrollo de lesiones premalignas y
finalmente CaCu [25].

Con respecto a la población mexicana, varios autores han reportado que los VPH de alto
riesgo que están presentes en pacientes con CaCu son el -16, -18, -51 y el -45 [26-29],
mientras que los VPH de bajo riesgo -6 y -11 están presentes en verrugas genitales y lesiones
de bajo grado [26, 28], la prevalencia de estos genotipos depende de la ubicación geográfica
de la población y el método de detección.

Actualmente el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC, por sus siglas
en inglés) y la Organización Mundial de la Salud han propuesto que la vacunación contra
VPH es un mecanismo sumatorio de prevención para el desarrollo de CaCu, pero con las
discrepancias respecto a la identificación de los genotipos más prevalentes en la población
mexicana [30], se sugiere que se desarrollen vacunas de acuerdo a los genotipos de VPH más
prevalentes en la población en la que se aplicarán, ya que existen algunos genotipos que no
se encuentran presentes en las vacunas actuales.

1.2.2. Comportamiento sexual y cáncer cervicouterino

El inicio de una vida sexual a temprana edad es un factor importante que contribuye al
desarrollo de CaCu [24, 31], debido al mayor tiempo de exposición a infecciones por VPH y
a que durante la adolescencia existe una inmadurez del tejido cervical, donde la lámina basal
de la zona de transformación se encuentra en constante exposición
[32].[32][32][32][32][32][32] Mujeres con una inicio de la vida sexual ≤ 16 años tiene un
riesgo de 2.3 - 2.5 veces mayor de presentar carcinoma invasivo comparado con las que
iniciaron su vida sexual de los 17 a los 20 años (1.5 – 2.1 veces) [31]. Por otra parte, los
embarazos a una edad temprana también representan un riesgo mayor para desarrollar CaCu,
debido a los cambios físicos como la exposición a hormonas esteroideas del embarazo [31].

El inicio de relaciones a temprana edad es un factor de riesgo importante ya que durante la

adolescencia existe una inmadurez del tejido cervical, por lo que la capa basal de la zona de
transformación se encuentra en constante exposición [32].

5
 1.2.3. Uso de anticonceptivos orales y el riesgo de desarrollar cáncer cervicouterino

Las mujeres que usan anticonceptivos orales tienen un mayor riesgo de desarrollar lesiones
de alto grado [33] y una mayor probabilidad de desarrollar CaCu [31], reportándose un riesgo
de 1.29 y 2.54 veces mayor riesgo de padecer carcinoma invasivo e in situ respetivamente
[34]. Con un mayor tiempo de exposición a los anticonceptivos orales se incrementa el riesgo
de desarrollar esta patología [35]. Por otro lado, las pacientes que además presentan
infecciones con VPH tienen un incremento del 2.82 veces mayor que las que no usaron
anticonceptivos [34].

1.2.4. Tabaquismo y cáncer cervicouterino

El desarrollo de CaCu se asoció con el uso de tabaco, fumar se considera un factor de riesgo
independiente [36]. Las mujeres que fuman tienen un riesgo significativamente mayor de
desarrollar carcinoma de células escamosas [37, 38] y el riesgo incrementa aún más con la
cantidad de cigarrillos que fuman por día y con un inicio a una edad más temprana [39].
Además, también se considera como un factor de riesgo para desarrollar lesiones de alto
grado, carcinoma in situ, pero no para adenocarcinoma [40].

Respecto a las infecciones por VPH se determinó que las mujeres fumadoras requieren de un
tiempo menor para desarrollar lesiones y cáncer, esto sugiere que el VPH y la duración del
tabaquismo tienen una interacción sinérgica [40], las mujeres fumadoras positivas a VPH
16/18 presentan un mayor riesgo de desarrollar CEE [36]. Se ha encontrado nicotina en la
mucosa cervical de mujeres fumadoras [36], los químicos presentes en el tabaco ocasionan
daños en el ADN de las células epiteliales cervicales.

1.3.Anatomía del cuello uterino

El conocimiento de la anatomía del cuello uterino y de los tipos epiteliales que lo conforman
es importante para el adecuado proceso de toma de muestra y el diagnóstico clínico, por lo
que a continuación describimos generalidades de estos dos aspectos.

6
El cuello uterino o cérvix se localiza en la parte más baja del útero, está dividido desde la
parte superior por la unión fibromuscular, el orificio interno separa el cuello uterino del
cuerpo muscular (útero) [41], conecta el útero con la vagina, tiene forma cilíndrica de
aproximadamente 3-4 cm de longitud y 2.5 cm de diámetro (Figura 3). Durante la vida de
una mujer ocurren cambios de tamaño y forma, relacionados con la edad, paridad y estado
hormonal [42]. El cérvix se mantiene en su posición debido al sostén de los ligamentos
uterosacral y lateral, estos consisten en tejido fibroso y músculo liso, contiene en su interior
nervios, vasos sanguíneos y linfáticos [41]. Por debajo del epitelio cervical se encuentra el
estroma que se compone principalmente de tejido elástico con una menor porción de músculo
liso, además tiene suministros vasculares, linfáticos y nerviosos [41, 42].

Figura 3. Anatomía del aparato reproductor femenino. Se divide principalmente en tres partes, útero, cérvix y
vagina. El cérvix está conformado por endocérvix y exocérvix, en la parte superior está delimitado por el
orificio interno que conecta con el útero y en la parte inferior con el orificio externo conectando con la
vagina. Creado con BioRender.com.

Anatómicamente el cuello uterino se divide en endocérvix y ectocérvix. El endocérvix es una

cavidad luminal recubierta de epitelio columnar que sirve de pasaje entre el orificio externo
e interno; el orificio interno o isthmus es el límite superior donde se marca la transición del
endocérvix a endometrio (en la cavidad uterina), el canal tiene una forma fusiforme de 7 a 8
mm en su parte más ancha en mujeres en edad reproductiva. En el orificio externo se localiza

7
el ectocérvix que se recubre de epitelio escamoso estratificado no queratinizante y continúa
hasta la vagina, esta zona es visible durante la revisión con espéculo. La unión escamo-
columnar (UEC) se localiza en el orificio externo donde se unen el endo y ectocérvix, en esta
unión se encuentra la zona de transformación (ZT) en donde se desarrollan la mayoría de los
cambios asociados al desarrollo de CaCu [41, 42].

1.3.1. Tipos epiteliales del cuello uterino

1.3.1.1. Epitelio columnar

La mucosa endocervical normal consiste en túbulos y criptas productoras de moco, éstas

están recubiertas de epitelio columnar (también denominado epitelio glandular), se dispone
como una sola lámina ordenada de células epiteliales altas y columnares cercanas a la
membrana basal, debido a que comprende una sola fila de células es más corta en altura
respecto al epitelio escamoso (Figura 4). En la fase proliferativa temprana los núcleos se
encuentran ordenados hacia la membrana basal y en la fase proliferativa tardía el citoplasma
contiene abundante moco (que sirve de lubricación para el cérvix y vagina). Por debajo de
las células columnares se encuentra una lámina simple de células columnares de reserva y a
simple vista es de apariencia rojiza debido a una mayor permeación vascular [42]. La parte
superior del cuello uterino está fusionado con el tejido endometrial en el cuerpo del útero y
la parte inferior se une al epitelio escamoso en la UEC. El canal endocervical no tiene una
superficie plana, sino que forma pliegues longitudinales hacia la luz del canal, criptas (a
menudo nombradas glándulas endocervicales) que pueden tener una longitud de 5-6 mm [42-
44]. El crecimiento excesivo del epitelio columnar puede verse como una masa rojiza que
sobresale del orificio externo en una examinación visual del cérvix. Este tipo de epitelio no
produce glucógeno, por lo que no se tiñe con yodo [43].

8
 Figura 4. Epitelio escamoso, columnar y unión escamocolumnar. Creado con BioRender.com.

1.3.1.2. Epitelio escamoso estratificado

El ectocérvix esta recubierto de epitelio escamoso estratificado no queratinizante bien

diferenciado, tiene entre 15-20 capas de células es de color rosa pálido cuando se observa en
una examinación visual. Este epitelio está organizado desde una membrana basal que son
células redondeadas con núcleos grandes y poco citoplasma, esta membrana separa el epitelio
del estroma. El proceso de diferenciación comienza en la lámina basal, donde las células se
dividen y forman las láminas parabasales, intermedias y superficiales, la diferenciación está
acompañada de un incremento de citoplasma y reducción del tamaño de núcleo. Las células
de la lámina intermedia y superficial tienen abundante glucógeno, el cual es fácilmente teñido
por yodo dando una coloración marrón o caoba. En mujeres postmenopáusicas las células de
la lámina parabasal no maduran, en consecuencia, el epitelio escamoso es delgado y atrófico,
se vuelve pálido y frágil, por lo que es propenso a traumatismos [42, 44].

1.3.2. Unión escamo-columnar

La UEC se observa como un escalón bien trazado que se encuentra entre el endo y ectocérvix
(Figura 4), y su localización varía dependiendo de la edad, estado hormonal, afecciones o
embarazo [41]. Durante la infancia y antes de la primera menarquia se encuentra muy cerca
del orificio externo del cuello uterino, durante la pubertad y periodo reproductivo los órganos
sexuales crecen debido a la presencia de estrógeno, el cérvix se agranda y el canal se enlonga,
esto en ocasiones produce la eversión del epitelio columnar hacia el ectocérvix, lo que se

9
conoce como ectropión; erróneamente llamado erosión o úlcera [42]. El moco de las células
columnares es destruido cuando el epitelio columnar sufre eversión hacia el ambiente ácido
de la vagina, entonces el epitelio es remplazado por epitelio escamoso metaplásico. La
metaplasia se refiere al cambio o remplazo de un epitelio por otro [45].

Durante la vida de una mujer, desde la edad reproductiva hasta la perimenopausia la

ubicación de la unión escamo columnar se “mueve” del ectocérvix hacia el orificio externo,
como consecuencia de la formación de nuevo tejido escamoso metaplásico en las zonas
expuestas de epitelio columnar. La formación de epitelio escamoso metaplásico inmaduro
evoluciona hasta un epitelio escamoso metaplásico maduro, este es muy similar al epitelio
escamoso estratificado original. El desarrollo del epitelio metaplásico inmaduro puede tener
dos caminos, el primero de ellos es cuando se forma el epitelio metaplásico maduro que
produce glucógeno, esto sucede en la mayoría de las mujeres, sin embargo, en una minoría
de mujeres el epitelio metaplásico inmaduro puede evolucionar a una displasia (epitelio que
muestra células atípicas con anomalías en núcleo y citoplasma), estos cambios pueden estar
asociados a infecciones con algún genotipo de VPH. El crecimiento desmedido puede
conducir a la formación de un epitelio displásico e incluso encaminarse a un cáncer invasor
[44, 45].

La zona de transformación (ZT) se conoce como la porción del cuello uterino en donde se
remplazó o se está remplazando el epitelio columnar por escamoso metaplásico. Es
importante reconocer la importancia de la zona de transformación ya que aquí es donde se
desarrolla la mayoría de las displasias o lesiones premalignas [44]. La detección temprana es
el primer paso para la prevención del desarrollo de CaCu.

1.4.Detección temprana de cáncer cervicouterino

Las células en la zona de transformación cambian gradualmente, cuando el tejido escamoso

metaplásico inmaduro presenta características atípicas como cambios en la proporción
núcleo-citoplasma y un crecimiento (proliferación) descontrolado, esto permite la formación
de displasias, neoplasias o lesiones premalignas que pueden evolucionar a carcinoma in situ

10
y al cabo de varios años a CaCu. Estos cambios graduales permiten la detección oportuna
mediante citologías cervicales (Papanicolau) y colposcopias.

1.4.1. Detección y tratamiento de las lesiones premalignas

La citología cervical es la prueba estándar para la detección de displasias o lesiones

premalignas y CaCu. El Papanicolaou (Pap) es una prueba de análisis citológico, que con una
adecuada toma de muestra se pueden detectar anomalías celulares tanto en el endo y
ectocérvix. A pesar de ser una prueba de bajo costo y fácil procesamiento presenta resultados
falsos negativos o falsos positivos, de un 50 a 60% de estos resultados es debido a una toma
de muestra inadecuada [46, 47].

El término de carcinoma y adenocarcinoma in situ fue definido por Broders en 1932, lo

describió como zonas en el epitelio en donde las células cancerígenas no han invadido el
estroma ni estructuras linfáticas y se encuentra aún delimitado por la membrana basal y puede
avanzar a un carcinoma invasor [48, 49]. Después fue necesario diferenciar la atipia cervical
que se encontraba entre un epitelio con características normales y el carcinoma in situ.
Reagan en la década de los cincuenta las denominó displasias que categorizó en tres grupos:
leve, moderada y severa [45, 50], se observó que algunos casos de displasia podían
retroceder, persistían o progresaban a carcinoma in situ, proceso en el que los cambios del
epitelio son continuos y evolutivos, por lo que en 1967 Richart determinó una nueva
clasificación, la cual tomaba en cuenta estos cambios, las neoplasias intraepiteliales
cervicales (NIC) se agruparon en tres grados NIC 1, 2 y 3, las NIC 1 correspondían a las
displasias leves, NIC 2 a las displasias moderadas y las NIC 3 a las displasias severas y
carcinoma in situ [45, 51, 52]. Años después se comenzaron a describir más alteraciones que
incluían células coilocíticas y condilomas asociados a infecciones por el VPH y en 1990 para
incluir estos nuevos hallazgos se reformuló la terminología de las neoplasias intraepiteliales
cervicales NIC de bajo grado: células coilocíticas y NIC 1, y NIC de alto grado: NIC 2, NIC
3 y carcinoma in situ [45, 53]. Fue necesario unificar las pruebas de laboratorio y la forma
en que se reportaban los resultados de las citológicas cervicales. En diciembre de 1988 el
National Cancer Institute (NCI) formuló la primera versión el Sistema Bethesda, este se
fundamentó en tres principios básicos para la terminología que debía ser (1) clínicamente

11
relevante, (2) razonablemente reproducible y flexible y (3) que refleje la compresión más
actual de neoplasia cervical [46].

Por primera vez para las lesiones escamosas se introdujeron dos términos nuevos las lesiones
escamosas intraepiteliales de bajo grado (LEIBG), que incluye infección por VPH / displasia
leve / NIC 1 y las lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (LEIAG), incluye displasia
moderada y grave / carcinoma in situ / NIC 2 y NIC 3. Para las “atipias” de células escamosas:
atípicas de significado indeterminado (ASC-US, por sus siglas en inglés) y en las que no se
puede excluir LEIAG (ASC-H, por sus siglas en inglés) [54-56].

Para las células glandulares se usó una terminología diferente debido a la naturaleza del
tejido, el adenocarcinoma endocervical in situ, adenocarcinoma: endocervical, endometrial,
extrauterino y NOS (not otherwise specified), para las “atipias” se clasifica como células
glandulares atípicas (AGC, por sus siglas en inglés) y las células glandulares atípicas que
favorecen la neoplasia. La “atipia” fue definida para los casos en que las características
citológicas no eran suficientes para clasificarlas como lesiones [54-56]. La correlación entre
los diferentes sistemas y terminología de lesiones premalignas se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Equivalencia de terminología entre displasia, NIC y el Sistema Bethesda

NIC modificada
NIC Sistema Bethesda
(1953) DISPLASIA
(1967) (2014)
(1990)
Negativo para lesión intraepitelial o
malignidad
Normal Normal Normal Cambios celulares benignos
(infección o reparación)
ASCUS/AGC
Atipia coilocítica,
Atipia condiloma plano, sin NIC de bajo grado LEIBG
cambios epiteliales
Displasia leve NIC 1 NIC de bajo grado LEIBG
Displasia moderada NIC 2 NIC de alto grado LEIAG
Displasia severa NIC 3 NIC de alto grado LEIAG
Carcinoma in situ NIC 3 NIC de alto grado LEIAG
Carcinoma invasor Carcinoma invasor Carcinoma invasor Carcinoma invasor

12
 NIC: neoplasia intraepitelial cervical, LEIBG: lesión escamoso intraepitelial de bajo grado, LEIAG: lesión
escamosa intraepitelial de alto grado. ASCUS: atipia de células escamosas de significado indeterminado,
AGC atipia de células glandulares de significado indeterminado

La prevención del CaCu se lleva a cabo a través de la citología cervical, las pruebas
moleculares que permiten la identificación del VPH y la vacunación profiláctica [46].

La colposcopia es un método para examinar el cuello uterino, es un método complementario

para la detección de CaCu y rutinariamente esta prueba es solicitada cuando existe una
LEIBG o LEIAG en el reporte citológico [57].

En México existe la Norma Oficial NOM-014-SSA2-1994 Para la prevención, detección,

diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia epidemiológica del cáncer cérvicouterino, en
esta norma se ha establecido el protocolo que sirve de guía para que el médico determine el
tratamiento a seguir con base en el resultado el reporte de la citología cervical.

En México la prueba de Papanicolaou es la principal herramienta para la detección de

lesiones premalignas y CaCu (IMSS 2011, Granados-García, Flores et al. 2014). Desde 2013
se han realizado entre 2.7 y 3 millones de pruebas de Papanicolau de primera vez cada año
(IMSS 2019), sin embargo, los falsos negativos resultan en altos costos de tratamiento al no
detectar a las mujeres con lesiones precursoras y cáncer (Granados-García, Flores et al.
2014).

1.5.Diagnóstico clínico y estadificación de cáncer cervicouterino

El diagnóstico de cáncer se realiza tomando una biopsia, mediante esta se determinan las
características histológicas del tumor y posteriormente el oncólogo evalúa el reporte
patológico y características clínicas de las pacientes para determinar el estadio en el que se
encuentra de acuerdo con la clasificación de la Federación de Internacional de Ginecología
y Obstetricia (FIGO) [58].

13
A finales de 1920 la Radiological Sub-Commission of the Cancer Commission of the Health
Organization of the League of Nations dictó las primeras reglas para clasificar y estadificar
los cánceres genitales entre ellos el de cuello uterino. Después en 1958 la International
Federation of Gynecology and Obstetrics lo adoptó, desde entonces estadificar los tumores
cervicales se volvió de gran importancia, ya que con esto se busca tener una terminología
uniforme para facilitar el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de las pacientes, además del
intercambio de conocimiento entre personal de la salud [58, 59].

Actualmente las directrices para determinar el estadio clínico en el que se encuentra una
paciente con CaCu se basan en la última actualización FIGO [58], en esta se han incorporado
estudios de imagenología y evaluación patológica de tejidos pélvicos y la evaluación de
nódulos linfáticos pélvicos y para-aórticos, a diferencia de la clasificación de 2009 en la que
se solo se incluían la observación macroscópica y la profundidad de la invasión estromal.

La estadificación FIGO se encuentra fundamentada en el tamaño de tumor, invasión

estromal, a nódulos linfáticos, pélvicos y para-aórticos así como la invasión a órganos
distantes, se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Estadificación FIGO para CaCu [58].

Estadio I
El carcinoma se encuentra estrictamente confinado al cuello uterino, la invasión lateral no modifica el estadio.
La invasión solo fue diagnosticada por microscopía, con una profundidad de invasión < 5.0 mm (los espacios
IA
vasculares y linfáticos no cambian el estadio)
IA1 Invasión estromal de < 3 mm
IA2 Invasión estromal de ≥ 3 mm y < 5 mm
IB La invasión tiene una profundidad de ≥ 5 mm y está limitada al cuello uterino
IB1 Carcinoma invasor con una profundidad de ≥ 5 mm y < 2 cm en la mayor dimensión
IB2 Carcinoma invasor con una profundidad de ≥ 2 cm y < 4 cm en su mayor dimensión
IB3 Carcinoma invasor con una profundidad de ≥ 4 cm en su mayor dimensión
Estadio II
El carcinoma invadió la parte baja del útero, pero no se extendió al tercio inferior de la vagina o a las paredes pélvicas
IIA Implicación limitada a los dos tercios superiores de la vagina sin invasión parametrial
IIA1 Carcinoma invasivo < 4 cm en su mayor dimensión
IIA2 Carcinoma invasivo ≥ 4 cm en su mayor dimensión
IIB Con invasión en parametrios, pero no en pared pélvica
Estadio III

14
 El carcinoma afecta el tercio inferior de la vagina y/o se extiende hasta la pared pélvica y/o causa hidronefrosis o
disfunción del riñón y/o involucra nódulos linfáticos pélvicos o para-aórticos
IIIA El carcinoma involucra el tercio inferior de la vagina, pero no tiene extensión a la pared pélvica
IIIB Extensión a la pared pélvica y/o hidronefrosis o disfunción del riñón (a menos que se sepa que se debe
a otra causa)
Involucra nódulos linfáticos pélvicos y para-aórticos, independientemente del tamaño de tumor y
IIIC
extensión
IIIC1 Metástasis únicamente en nódulo linfático pélvico
IIIC2 Metástasis en nódulo linfático para-aórtico
Estadio IV
El carcinoma se ha extendido más allá de la pelvis o ha involucrado (probado por biopsia) la mucosa de vejiga o recto.
Un edema ampolloso no permite que un caso se asigne a estadio IV
IVA Propagación de crecimiento a órganos adyacentes
IVB Propagación a órganos distantes

La clasificación UICC TNM Classification of Malignant Tumors (Tabla 3), es un sistema

basado en la extensión ganglionar primaria y regional del tumor, así como la ausencia o
presencia de metástasis, esta clasificación tiene tres categorías T: describe el sitio del tumor
primario, N: describe los nódulos linfáticos afectados y M: presencia o ausencia de la
diseminación de metástasis a distancia [58, 60]. Esta clasificación se usa con menos
frecuencia en el diagnóstico de CaCu, además no se ha unificado con la reciente actualización
de FIGO.

Tabla 3. Clasificación TNM para CaCu y FIGO [61]

TNM FIGO
TX
El tumor primario no se puede evaluar
T0
No existe evidencia del tumor primario
Tis 0
Carcinoma in-situ (carcinoma pre-invasivo)
T1 I
Carcinoma confinado al cuello uterino
T1a IA Carcinoma invasivo diagnosticado sólo por microscopia
T1a1 IA1 Invasión estromal ≤ 3.0 mm de profundidad y ≤ 7.0 mm en diseminación horizontal
T1a2 IA2 Invasión estromal > 3 mm y ≥ 5 mm
T1b IB Lesión clínicamente visible confinada al cérvix o lesión microscópica más grande que T1a2/IA2
T1b1 IB1 Lesión clínicamente visible, 4 cm o menos en su mayor dimensión

15
 T1b2 IB2 Lesión clínicamente visible > 4 cm en su mayor dimensión
T2 II
El tumor invade más allá del útero, pero no la pared pélvica o el tercio inferior de la vagina
T2a IIA Sin invasión parametrial
T2b IIB Con invasión parametrial
T3 III
El tumor se ha extendido a la pared pélvica, involucra el tercio inferior de la vagina o causa hidronefrosis o mal
funcionamiento del riñón
T3a IIIA El tumor involucra el tercio inferior de la vagina, pero no extensión a la pared pélvica
T3b, N1 IIIB El tumor se extiende a la pared pélvica o causa hidronefrosis o mal funcionamiento del riñón
T4 IVA
El tumor invade la mucosa del vejiga o recto o se extendió más allá de la pelvis
M1 IVB Propagación a órganos distantes

1.5.1. Biomarcadores en cáncer cervicouterino

El principal método de prevención y detección para CaCu es el Pap y el análisis histológico

de muestras cervicales. Sin embargo, el Pap tiene limitantes en la sensibilidad y
especificidad, debido a errores de muestreo, interpretación de los resultados y a los falsos
positivos/negativos. Por otro lado, el análisis histológico que se obtiene mediante una biopsia
del cuello uterino está limitado a la experiencia del personal que lo analiza. Con el tiempo se
han buscado nuevos marcadores específicos de la enfermedad, con poco éxito, algunos de
estos se describen a continuación.

CEA, CA19-9, CA125 se han estudiado como biomarcadores séricos en CaCu. Se encontró
que incrementaban en el suero de las pacientes, CEA y CA 19-9 correlacionaron con el
estadio clínico y fueron aún más elevados en pacientes con adenocarcinoma [62].

La identificación del genoma de VPH se ha propuesto como un marcador temprano de CaCu,

un resultado positivo siempre requiere de seguimiento. La identificación de los genotipos,
así como de las oncoproteínas E6 y E7 son importantes, ya que son capaces de modificar
funciones fundamentales como regulación de la transcripción, reparación del ADN, evasión
del sistema inmune, están implicadas en la organización y diferenciación epitelial, control
del ciclo celular, promueven la proliferación, polaridad, y contactos célula-célula [63].

16
La proteína p16INK4a que actúa como un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina en células
normales y es un integrante del control del ciclo celular. El incremento de los niveles de
p16INK4a resulta en la hiperfosforilación de pRB y la liberación del factor de transcripción
E2F, permitiendo la progresión del ciclo celular en la fase S [64]. En tejidos cervicales
normales no es evidente la presencia de p16INK4a por el contrario en muestras de lesiones de
alto grado se identifica con una sensibilidad de 99.9% y especificidad de 100%, sin embargo,
el valor pronóstico de p16INK4a ha sido poco explorado en biopsias cervicales [63].

La expresión de Ki-67 se asocia con la proliferación celular, se presenta durante la fase activa
G1, S, G2 y mitosis, pero no en G0. El marcaje de Ki-67 en tejidos correlaciona con peores
pronósticos de la enfermedad [65]. Se ha estudiado en cáncer de mama y próstata. Ki-67 en
muestras de tejido cervical no fue detectada en tejido normal, pero fue positiva en lesiones
de bajo y alto grado y carcinoma escamoso, y correlacionó positivamente con el grado de
lesión. Ki-67 presentó una sensibilidad de 95.2% y una especificidad de 86.7%.
Posteriormente se evaluó el valor diagnóstico de la combinación de p16 y Ki-67. Los datos
correlacionaron significativamente. La sensibilidad de la combinación fue de 94.8% y la
especificidad de 93.2% [66].

El antígeno de células escamosas (SCC-Ag), es una glicoproteína usada como marcador

tumoral temprano para diagnóstico y valoración de la respuesta a tratamiento en la práctica
clínica. Los niveles séricos de SCC-Ag se correlacionaron con el estadio clínico [63] y la alta
expresión de SCC-Ag se asoció estadios clínicos más avanzados, tumor primario de mayor
tamaño, afectación ganglionar y linfática [67], mal pronóstico y menor supervivencia [68].

A pesar de existir una batería amplia de biomarcadores tanto para diagnóstico como
seguimiento de tratamiento del CaCu, no han sido usados como parte de la práctica clínica.
Por lo que es importante continuar con la búsqueda y en el futuro la aplicación de estos en el
campo de la medicina.

17
 1.6.Galectinas

1.6.1. Generalidades de las galectinas

Las galectinas son una familia de proteínas cuya principal función es el reconocimiento de
glicoconjugados que presentan en su estructura arreglos glicánicos con galactosa. Estas
lectinas se unen a glicoconjugados que en su estructura tienen β-galactósidos Gal
β1→4GlcNAc [69]. Los glicoconjugados pueden encontrarse unidos a péptidos, proteínas o
lípidos [70]. Las galectinas son proteínas que pertenecen a lectinas tipo S; se denominaron
así ya que el primer miembro descubierto dependía de la solubilidad en sulfidrilo [71],
también son denominadas S-Lac ya que son solubles y reconocen lactosa [72].

Las galectinas tiene la capacidad de reconocer glicoconjugados gracias a su dominio de

reconocimiento a carbohidratos (carbohydrate-recognition domain, CDR por sus siglas en
inglés), y tienen una extensión aproximada de 130 aminoácidos [73]. El CDR
estructuralmente se compone de 5-6 cadenas en β-hojas antiparalelas en configuración β-
sandwich [72] algunos miembros están unidos por un péptido de unión y otros tienen un
extremo peptídico. El reconocimiento e interacción con los carbohidratos se realiza mediante
puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas y fuerzas de Van der Waals [70]. Se han
identificado 15 galectinas; 12 de las cuales han sido identificadas en humanos, estas se
clasifican de acuerdo con el CDR y se agrupan en tres subtipos:
Las galectinas prototipo comprenden a las galectinas con un único CDR, este puede asociarse
con otro CDR para formar homodímeros. Las galectinas 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14 y 15
pertenecen a este grupo.
El subtipo quimérico que se caracteriza por tener un único CDR y un extremo no lectina en
el extremo amino terminal. A través del CDR en el carboxilo terminal es capaz de
interaccionar con carbohidratos y el extremo amino interacciona con otros ligandos, como
polipéptidos y polinucleótidos, este extremo es rico en prolina, glicina y tirosina, y contribuye
a la auto-agregación y oligomerización, además es sensible a metaloproteinasas. El único
miembro de este grupo es la galectina-3.
Repetición en tándem: este grupo tiene dos CDRs unidos mediante un pequeño dominio
peptídico de 5-50 aa, este grupo es capaz de formar oligómeros con otras galectinas u otras
moléculas de diferente naturaleza, incluye a las galectinas 4, 6, 8, 9 y 12 [70]

18
La organización genética de las galectinas en mamíferos se ha conservado a través de la
evolución, con el paso del tiempo ocurrió una duplicación de un gen mono-CDR, resultando
en un gen bi-CDR. Los N-CDR y C-CDR se bifurcaron en dos subtipos: F4-CDR y F3-CDR,
así las galectinas con un CDR pertenecen al subtipo F3 (galectinas-1, 2, 3, 5) o F4 (galectinas
7, 10, 13, 14) y las de repetición en tándem tienen ambos genes [70, 74]. Algunos transcritos
de las galectinas son procesadas por splicing alternativo, generándose diferentes formas de
ARNm [70] que dan origen a variantes de ARN mensajero o proteicas como es el caso de la
galectina-8 en humano [75], la galectina-9 (Gal-9) en humano [76] o la galectina-4 (Gal-4)
en cerdo [77].

1.6.2. Mecanismo de secreción de las galectinas

Las galectinas son sintetizadas en el citosol, en polisomas libres donde son acumuladas antes
de la secreción [70]. Sobre el mecanismo de secreción de la familia de las galectinas se ha
descrito muy poco, estas proteínas carecen de secuencia de señalización y de exporte, además
no presentan dominios de anclaje a la membrana, por todas las características anteriores se
ha propuesto que son secretadas por una vía no clásica, además no atraviesan el retículo
endoplasmático ni el aparato de Golgi, por lo que no presentan modificaciones
postraduccionales como glicosilación [78].[78]. Las galectinas son exportadas hacia la
superficie celular mediante vesículas (exosomas, que se producen mediante protuberancias
en la membrana, donde se ha acumulado la proteína) [79], después de secretarse las galectinas
pueden re-ingresar a la célula por endocitosis y ayudar a remodelar el citoesqueleto para
modular la propagación y adhesión celular a través de la recirculación de integrinas [80].

El mecanismo de secreción de las galectinas -1 y -3 se han estudiado en comparación con el

resto de las galectinas. La secreción en mioblastos de la galectina-1 (Gal-1) puede ocurrir por
evaginaciones de la membrana plasmática en forma de vesículas enriquecidas [70]. La
galectina-3 (Gal 3) tiene la capacidad de formar oligómeros que permiten su secreción
mediante la vía no convencional esto es dependiente de su dominio N-terminal [81], cuando
se eliminaron los primeros 12 residuos del N-terminal se bloqueó su exporte al sobrenadante
celular [82]. Gal-3 puede interaccionar con lípidos de la membrana y moverse
espontáneamente a través de la bicapa lipídica, una translocación directa que no requiere de
proteínas membranales. La interacción de Gal-3 con la membrana plasmática puede

19
involucrar dominios ricos en colesterol, donde Gal-3 se concentra y forma multímeros o
interactúa con enlaces covalentes con otras proteínas [83, 84].

1.6.3. Localización subcelular y unión a ligandos

La localización subcelular de las galectinas depende del tipo celular en que se expresa, se ha
detectado en citoplasma, en núcleo, formando parte de la matriz extracelular e
interaccionando con receptores anclados en la membrana, también en circulación en torrente
sanguíneo [70, 85]. En condiciones fisiológicas las galectinas se pueden encontrar en forma
monomérica, algunas pueden formar entramados con los glicoconjugados provocando
agregaciones [85], además las galectinas con CDR diferentes pueden formar dímeros no
covalentes para incrementar su valencia, esta multivalencia permite llevar a cabo funciones
extracelulares eficientemente. La Gal-9 regula su multivalencia mediante la formación de
entramados (galectin-ligand lattices) con glicanos de alta afinidad en la superficie celular
[86]. Las galectinas se unen a ligandos que presentan en su estructura -galactósidos, como
moléculas componentes de la matriz extracelular: laminina, fibronectina celular y plasmática,
vitronectina, pueden modificar la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y en
consecuencia las interacciones células-células o células-MEC [87].

Las galectinas también pueden formar interacciones proteína-proteína, como se ha

reportado para la Gal-1 [87]. El reconocimiento e interacción con sus ligandos es complejo,
este depende de varios factores como: la afinidad de unión, la presentación espacial de los
glicanos [88], ya que esto puede dar origen a la formación de especies multivalentes [86, 89].

1.6.4. Funciones celulares de las galectinas

Las galectinas se han conservado a través de la evolución, lo que apoya su participación en

procesos celulares importantes. Se ha reportado su participación en el desarrollo temprano
de organismos, en la regeneración y mantenimiento de tejidos, participan en la modulación
de la respuesta inmune y en el control o progresión del cáncer mediante interacciones extra,
intra e intercelulares [90].

En la superficie celular pueden modular funciones como adhesión celular, regulación del
crecimiento celular, apoptosis [91], inflamación, embriogénesis, diseminación tumoral,

20
pueden interaccionar con ligandos para regular las funciones celulares e intervenir en
procesos fundamentales como la expresión génica [70, 73] y el splicing del pre-ARNm (Gal-
1 y Gal-3 [91]) [70].

La modulación de la adhesión celular a través de la participación de las galectinas se debe al

reconocimiento de glicoproteínas presentes en la membrana y matriz extracelular (MEC),
estas proteínas son capaces de reconocer poli-N-acetilactosamina, el glicano de mayor
presencia en la MEC, también reconoce laminina, fibronectina, proteínas de membrana
asociadas a lisosomas (LAMP 1 y 2) y CD45, las galectinas modulan interacciones célula-
célula y célula-MEC [92]. La Gal-1 inhibe la interacción de mioblastos con laminina,
mediante el bloqueo del receptor de laminina.

1.6.5. Expresión de galectinas en tejidos

Las galectinas se expresan en una amplia variedad de tejidos de mamíferos, algunas

galectinas tienen expresión tejido-específica que puede ser regulada durante la diferenciación
celular. Las galectinas son capaces de regular procesos como el desarrollo de órganos y
tejidos, en algunas ocasiones la expresión se modifica bajo ciertas condiciones fisiológicas o
patológicas [93].

Las galectinas se expresan en diferentes tejidos humanos, algunas coexisten en el mismo

tejido, mientras otras son tejido específicas [73, 93], en algunos tejidos las galectinas se
expresan en ciertas etapas del desarrollo como la embriogénesis o son características de
alguna etapa de desarrollo [92]. Algunos ejemplos de la expresión de galectinas en tejidos se
muestran a continuación: Gal-1 se expresa en músculo esquelético, corazón, placenta, tejido
linfático; la Gal-3 se expresa especialmente en macrófagos y células epiteliales; Gal-4 se
expresa principalmente en intestino, estómago, neuronas, vasos sanguíneo; galectina-6 (Gal-
6) en tracto digestivo; galectina-7 (Gal-7) en tracto gastrointestinal, epitelio, corazón fetal;
galectina-8 (Gal-8) hígado, riñón, músculo cardiaco, pulmón y cerebro; galectina-9 (Gal-9)
en linfocitos-T, intestino delgado, hígado, epitelios; galectina-14 (Gal-14) en eosinófilos [85,
93].

21
 1.6.5.1. Galectinas y el desarrollo de cáncer

Los sellos distintivos del cáncer “Hallmarks of cancer” descritos por Hanhan y Weinberg,
están relacionados con los procesos para el crecimiento, supervivencia, invasión y metástasis
del tumor [94-96]. Las galectinas han ganado cada vez más importancia debido a que
participan en procesos como proliferación, invasión y metástasis, angiogénesis, control de
ciclo celular entre otras. Hablar de galectinas y cáncer es un tema amplio, sin embargo, se
proporcionarán ejemplos de algunas de éstas.

La capacidad que presentan las células cancerígenas para invadir otro tipo de tejidos a
distancia se conoce como metástasis, en primer lugar la célula maligna invade el tejido
circundante del tumor primario, entra en la microvasculatura linfática y sanguínea (lo que se
conoce como intravasación), si es capaz de sobrevivir se traslada mediante el torrente
sanguíneo a los microvasos de tejidos distantes y sale del torrente sanguíneo (extravasación),
se adapta al microambiente nuevo, comienza a proliferar y forma el tumor secundario
macroscópico ( la colonización) [97].

La sobre regulación de Gal-1 promueve la migración e invasión en células de cáncer de

ovario. En tejido de pacientes se encontró una mayor expresión tanto del ARNm y como de
la proteína, y se identificó en el citoplasma y en células del estroma. La expresión de Gal-1
se asoció con invasión, estadio avanzado, metástasis y mayor recurrencia [98]

En cáncer colorrectal se producen cantidades considerables de mucina en la superficie

celular, esta es una glicoproteína altamente glicosilada [99]. Mucina-1 (MUC1) es una
proteína transmembrana, el 50%-80% de su peso está representado por glicanos O-GalNAc
[100]. MUC1 está incrementada en diferentes tipos de cáncer y se asocia con malignidad y
mal pronóstico [101]. MUC1 presenta un incremento de oligosacáridos cortos, como el
antígeno oncofetal Thomsen-Friedenreich (TF), este se encuentra oculto por la glicosilación
y sialilación, sin embargo, se revela en procesos de cáncer. MUC1 es un ligando natural de
Gal-3 y mediante el antígeno TF induce la polarización de MUC1 incrementando así la
adhesión. La sobreexpresión de MUC1 en la superficie celular sirve de protector para inhibir
la adhesión entre células cancerosas y endotelio, la interacción de MUC1 con Gal-3 reduce
el efecto protector debido al agrupamiento/polarización y la exposición de moléculas de

22
adhesión como CD44 y el ligando para E-selectina endotelial y en consecuencia promueve
la metástasis [102].

El reconocimiento de Gal-3 con polilactosaminas permite las interacciones homotípicas y

heterotípicas que se encuentran involucradas en el desarrollo de cáncer [103]. Además, Gal-
3 reconoce a -galactosa en posición terminal en el antígeno T, promoviendo la adhesión de
las células cancerígenas al endotelio y en consecuencia la metástasis; esto fue suprimido
mediante una inhibición con P-30, un péptido capaz de enmascarar al antígeno-T [104].

La interacción del gangliósido GM1 y Gal-1 en la superficie celular de neuroblastoma

humano modula la proliferación celular, por otro lado, la Gal-4 tiene la capacidad de unirse
independientemente del gangliósido GM1, pero no actúa como un regulador del crecimiento
[105].

En muestras de tejido de pacientes con CaCu la expresión de Gal-9 se asoció con el tamaño
de tumor. Particularmente las biopsias con alta expresión de Gal-9 se correlacionaron
positivamente con un mayor tamaño de tumor. El tamaño de tumor se considera un factor
crítico para establecer el tratamiento y es un factor pronóstico independiente en cada etapa
de CaCu. La alta expresión de Gal-9 se asoció con estadios más avanzados (III-IV). Gal-9
podría estar involucrada con el desarrollo tumoral ya que en otros tipos de cáncer facilita la
proliferación y progresión del ciclo celular [106].

En tejidos de pacientes con carcinoma hepatocelular, Gal-9 tuvo una menor expresión
respecto su contraparte saludable, además en pacientes con alta expresión de Gal-9 el
pronóstico fue desalentador [107].

La expresión de Gal-9 tanto el ARNm como la proteína en tejido de muestras de pacientes

con adenocarcinoma pancreático ductal fue mayor respecto a tejidos sanos, se expresó tanto
en células tumorales como en leucocitos intratumorales. Aunque no se asoció con el tamaño
de tumor, después de una quimioterapia neoadyuvante la expresión de Gal-9 se redujo
significativamente. Adicionalmente se encontró que las células infiltradas en el tumor tienen
una mayor expresión de Gal-9 respecto a las células de muestras sanguíneas del mismo
paciente, como las células T, especialmente las TCD4+ TCD8+ [108].

23
 1.6.6. Galectinas séricas como biomarcadores en enfermedades

Las galectinas son de naturaleza soluble, por lo que pueden encontrarse en circulación, suero
y/o plasma [85], los niveles séricos o plasmáticos de estas proteínas podrían fungir como
marcadores para diagnóstico de cáncer.

Los niveles de Gal-1 y Gal-3 en suero fueron más altos en los pacientes con enfermedad
inflamatoria del intestino (EII). La concentración óptima de Gal-1 para diferenciar pacientes
con EII de los sanos, fue de 4.1 ng/ml con una sensibilidad de 71% y una especificidad de
87% por otro lado, Gal-3 tuvo un límite de 38.5 ng/ml con una sensibilidad de 53% y
especificidad de 87%. Estas galectinas pueden inducir la secreción de citocinas
proinflamatorias al endotelio, epitelio o células T. La interacción de estas galectinas
promueve la secreción endotelial de IL-6, G-CSF y GM-CSF y la epitelial de IL-10, IL-25 Y
TGF-b1. Por sí misma la condición inflamatoria de la EII se asocia directamente con la
secreción de citocinas, el incremento de los niveles Gal-1 y -3 en suero puede participar en
la progresión y su detección tiene un potencial de utilidad clínica como biomarcador [109].

En pacientes con accidentes cerebrovasculares ateroscleróticos, los niveles séricos de Gal-3,

Gal-9 y Gal-3BP (galectin-3 binding protein) fueron más altos respecto a los controles. Los
niveles más altos de Gal-3 sérica permiten predecir de forma independiente un resultado
desfavorable en el día 90 después de un accidente isquémico cardiovascular. Gal-3 podría
funcionar como un blanco terapéutico para este tipo de patología [110].

1.6.6.1. Galectinas séricas en cáncer

En diferentes tipos de cáncer los cambios de concentración de las galectinas circulantes se

ha asociado con malignidad y características clínico-patológicas. Aún se desconoce si su
presencia en suero y/o plasma es debido a la secreción desde el tejido o la respuesta del
sistema inmune.

En pacientes con cáncer de ovario epitelial y metástasis, la concentración de Gal-1 en suero

incrementó y luego de la cirugía de resección este disminuyó. Es posible que la presencia de
Gal-1 circulante sea producida y secretada por los tumores, aunque también células peri
tumorales, como las estromales son capaces de secretarla (en estudios in vitro). Gal-1 puede

24
favorecer la metástasis mediante las interacciones entre las células tumorales y las proteínas
de la matriz extracelular y promoviendo la permeabilidad vascular del tumor [98].

El nivel de Gal-3 plasmático y sérico incrementó en los pacientes con cáncer de mama [111,
112]. En los pacientes con tumores de bajo grado (I y II) y los sometidos a quimioterapia la
concentración en plasma fue aún mayor. Después de 84 meses libres de enfermedad los
pacientes presentaron concentraciones hasta 5 veces mayor respecto a los niveles antes de la
quimioterapia, los niveles de Gal-3 en plasma podrían ser un predictor de la respuesta a la
quimioterapia [111]. En suero de pacientes se determinó el punto de corte para predecir el
desarrollo de cáncer de mama en 3.17 ng/ml con una sensibilidad de 75% y especificidad de
65.71% [112]. Por otro lado, Gal-1 sérica incrementó en pacientes con estadios avanzados y
se correlacionó con tamaño de tumor. Se mostró que la combinación de los marcadores
CA15-3 y Gal-1 mejoró la sensibilidad y especificidad para el diagnóstico y pronóstico de
cáncer de mama [113].

Los pacientes con cáncer pancreático mostraron una correlación positiva de Gal-3 sérica con
los parámetros clínicos de sexo, edad, tamaño de tumor, localización de tumor metástasis
ganglionar, metástasis a distancia y estadio TNM. Los niveles de Gal-3 sérica disminuyeron
después de la resección radical y el seguimiento de seis meses mostró que la tasa de
metástasis y recurrencia fue menor en este grupo, mientras el nivel de Gal-3 sérica sea mayor
la supervivencia disminuye. Gal-3 sérica podría servir como un marcador predictivo para
pacientes de alto riesgo, ya que en el estadio III presentó una mejor sensibilidad y
especificidad [114].

En cáncer gástrico Gal-3 sérica incrementó y se correlacionó significativamente con

metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis a distancia. La capacidad para distinguir
entre un paciente con cáncer gástrico de uno sano fue de 0.843 con un valor de corte de 13,30
ng/ml, una sensibilidad del 77% y la especificidad de 82,7%. Gal-3 podría ser biomarcador
sérico potencial para el diagnóstico de cáncer gástrico [115].

Gal-9 es una de las proteínas que se ha estudiado recientemente y se ha reportado un

incremento en la concentración sérica de pacientes con cáncer. Los niveles séricos de Gal-9
en pacientes con adenocarcinoma pancreático ductal fueron más elevados respecto a los

25
controles sanos, con una capacidad discriminativa de 0.776, Gal-9 tiende a incrementar en
estadios I-III, pero en el estadio IV disminuyó, en este estadio los pacientes supervivientes a
largo plazo (>12 meses) los niveles de Gal-9 fueron más bajos respecto a los de corto plazo
(<12 meses). Este tipo de cáncer presenta una supervivencia a 5 años del 9%, actualmente y
CA19-9 es el único biomarcador aprobado para este tipo de cáncer. Los pacientes podrían
estratificarse como supervivientes a largo o a corto plaza en función a los niveles séricos de
Gal-9 [108].

En pacientes con carcinoma hepatocelular Gal-9 plasmática tuvo una mayor concentración
que en los controles sanos, el análisis mostró que Gal-9 puede ser un predictor independiente
de recurrencia, metástasis y de pronóstico [107]. En pacientes con leucemia linfocítica
crónica se encontró un incremento de Gal-9 sérica que se asoció con progresión de la
enfermedad, los factores pronósticos negativos y la respuesta al tratamiento, se proponen más
estudios para considerarlo como un marcador pronóstico [116].

Nuestro grupo de trabajo se ha enfocado a la búsqueda de biomarcadores de diagnóstico,

pronóstico y respuesta a tratamiento. Gal-9 sérica incrementó la concentración en pacientes
con CaCu respecto a los controles sanos y lesiones intraepiteliales de bajo y alto grado [117,
118]. Al analizar las características clínico-patológicas inherentes de la enfermedad se
observó que Gal-9 sérica tiende a incrementar con etapas clínicas más avanzadas. Respecto
al tratamiento de CaCu se observó que Gal-9 sérica incrementó en las pacientes después de
recibirlo, las pacientes que respondieron al tratamiento sin presentar recaídas mostraron una
menor concentración de Gal-9 sérica después de seis meses respecto a las no respondedoras,
por lo que Gal-9 sérica podría ser un indicador de progresión de la enfermedad [117].

26
 1.7.La participación de la galectina-4 en las funciones celulares y el cáncer

1.7.1. Características generales

La Gal-4 es una proteína codificada por el gen LGALS4, el cual se encuentra en el locus
19q13.2 (ID: 3960), tiene un tamaño aproximado de 12 Kb, y se transcribe a un ARNm de
1.3 Kb, el mensajero maduro está formado por 10 exones [119]. Mediante un análisis in silico
se han identificado algunos sitios putativos de inicio de la transcripción, el principal sitio de
inicio se localizan en el nucleótido (nt) -55 a 33 bases río debajo de la caja TATA; otros sitios
de inicio de la transcripción se han identificado en las posiciones -184, -65 y -58, presentando
niveles más bajos de transcripción [120]. En la región promotora se han reportado sitios
putativos de unión a factores de transcripción como: HNF-4, MyoD, c-Rel, HNF-3β, CAAT,
C/EBP, estos factores se han asociado al desarrollo epitelial, diferenciación y transformación
maligna, también se encontró un sitio de unión para la proteína de unión potenciadora
(enhancer binding protein) y otro para HFH-2 (Figura 5). CAAT y C/EBP se expresan en
células diferenciadas de hígado, en células epiteliales de intestino, también se expresan
durante la diferenciación de queratinocitos y en epitelio escamoso [120].

Figura 5. Representación esquemática de la región promotora del gen LGALS4. Se presentan los sitios
putativos de unión a factores de transcripción. Imagen modificada de Huflejt &Leffler 2004.

La Gal-4 es una proteína que pertenece al subtipo de repetición en tándem, tiene dos CDR
distintos en el extremo N-terminal y en el C-terminal, estos dominios se encuentran
conectados por un péptido enlazador [120]. La proteína tiene un peso aproximado de 36 kDa
y se conforma de 323 residuos de aminácidos (aa). El dominio N-terminal comprende los
aminoácidos 1 a 150 aa, el péptido enlazador 151 - 178 aa y el domino C-terminal 179 - 323
aa [121].

27
Ambos CDRs tiene estructura de  sándwich en una topología de jellyroll, cada monómero
está formado por dos láminas  antiparalelas, cada lámina está compuesta por seis cadenas
antiparalelas -hebras (F0-F5 / F0′-F5 ′ y S1-S6 / S1′- S6) (Figura 6) [121-123]. En solución
a pH fisiológico la distribución de carga del dominio C terminal es principalmente positiva
y en el N-terminal tiene una carga más heterogénea en el lado cóncavo existe una carga
positiva en donde se encuentra el sitio de unión [122]. El sitio de unión se encuentra en un
bolsillo poco profundo de las cadenas S4/S4', S5/S5' y S6/S6 'y el bucle adyacente S5/S5'.
Las cadenas S2/S2’ y S3/S3’ en los dominios N- y C- terminal presentan variaciones en los
aminoácidos, éstas contribuyen a la selectividad de las interacciones con ligandos [121].

Figura 6. Representación esquemática de los dominios de reconocimiento de Gal-4. Ambos dominios se

componen de dos láminas  antiparalelas, cada lámina está formada por seis hebras antiparalelas

Los CDRs y el péptido enlazador son capaces de interactuar entre sí mediante interacciones
débiles (puentes de hidrógeno y enlaces no covalentes), estas interacciones son transitorias,
por lo que la Gal-4 se encuentra en constante dinamismo [121]. El péptido enlazador tiene
un alto contenido de prolina (28.6%) que limita el movimiento de esta región y proporciona
estabilidad a la proteína, esta es una característica de las galectinas de repetición en tándem
que les proporciona dinámicas únicas y así mismo funciones únicas [124]. Debido a que el
péptido enlazador es susceptible a sufrir proteólisis, existen pocos estudios en los que se ha
caracterizado la estructura completa de Gal-4 [121]. La longitud del péptido enlazador
modifica el reconocimiento de las estructuras glicánicas; la reducción de la longitud y/o
eliminación del péptido enlazador disminuye la capacidad de reconocimiento de Gal-4

28
debido a que modifica la topología de dos sitios de reconocimiento que adoptan un diferente
modo de presentación espacial [88, 105].

La identidad de secuencia de los CDRs de Gal-4 es de 34-40 % [125], justo las diferencias
entre las secuencias de los CDRs les confieren diferente capacidad de reconocimiento y
afinidad por estructuras que tienen galactosa en diferentes arreglos glicánicos e incluso de
moléculas que no la tienen.

Gal-4 tiene afinidad por lactosa (Gal1-4Glc) [120], MUC1 (proteína que tiene O- y N-
glicosilaciones) [21], los glicanos que conforman el sistema de grupos sanguíneos ABH;
como al tetrasacárido A tipo 1 (GalNAc1-3(Fuc1- 2) Galβ1-3GlcNAcβ) y tipo 2
(GalNAc1-3(Fuc1-2)Galβ1-4GlcNAcβ) y en menor medida los tetrasacáridos B y el
trisacárido H (tipo 1 Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ) [126]. Sin embargo, cada DRC presenta
diferente afinidad por estructuras de glicanos; solo por mencionar algunos ejemplos, el DRC-
C tiene afinidad por Tββ (Galβ1-3GalNAcβ), TF (Galβ1-3GalNAcα), antígeno T (Galβ1-
3GalNAc), el DRC-N reconoce el glicano LN (Galβ1-4GlcNAcβ) y glicanos con el motivo
Lec (Galβ1-3GlcNAcβ) [120, 126].

1.7.2. Mecanismo de secreción y exporte de la galectina-4

Existen pocos estudios acerca del mecanismo de secreción o exporte de la Gal-4, al igual que
otros miembros de la familia, la Gal-4 carece de secuencia de señal para su transporte a
retículo endoplásmico (RE) y tampoco atraviesa el aparato de Golgi, por lo que es una
proteína no glicosilada [73, 127]. La Gal-4 puede localizarse tanto en el núcleo, como en el
citoplasma de las células, así como en el espacio extracelular [73].

Recientemente se encontró que la Gal-4 presenta en su secuencia péptidos que pueden ser
fosforilados por la familia de cinasa Src, la cual es capaz de fosforilar a la Gal-4 en la tirosina
320 del extremo C-terminal, siendo esta tirosina determinante para su secreción [128],
demostrándose que el estado de fosforilación es importante para la secreción de esta proteína.
Similarmente la Gal-3 es fosforilada en residuos de tirosina, y posteriormente es secretada
en presencia de calpaína-4 [129], aún se desconoce la ruta de secreción de la Gal-4, pero
podría ser similar a la Gal-3.

29
 1.7.3. Expresión de galectina-4 en tejido humano

La Gal-4 se identificó por primera vez en el tracto digestivo: en intestino delgado, colon y
recto [125]; posteriormente se reportó en otros tipos de tejidos, identificándose tanto el
ARNm como la proteína. En bases de datos el ARNm se ha reportado en islotes de
Langerhans, tejido embrionario, colon, recto, apéndice, vejiga, hígado [130, 131] y cérvix
[132]. La expresión de la proteína se ha reportado en tejido de colon, mama, ovario, pulmón
[120], vesícula biliar, hígado, páncreas y apéndice [130].

1.7.4. Funciones biológicas de galectina-4

La Gal-4 participa en la estabilización de las balsas lipídicas, éstas son un tipo de plataformas
compuestas de esfingolípidos y colesterol que se proyectan hacia el exterior de las células
sobre la membrana [133], inicialmente la Gal-4 se encontró como un componente de la
porción soluble en detergente de intestino delgado junto a glicoproteínas de membrana,
después se co-localizó en el borde del cepillo (brush border membrane) de la zona apical de
enterocitos junto a sus ligandos aminopeptidasa-N y sacarasa-isomaltasa [134, 135], enzimas
que están altamente glicosiladas [136, 137]. La Gal-4 se externaliza y permanece en la
superficie de las balsas lipídicas, estabilizándolas mediante la formación de entramados con
las glicoproteínas y glicolípidos, ayudando a proteger estas enzimas de la solubilización
[135].

La Gal-4 funciona de guía en el tráfico vesicular, en estas vesículas se transportan proteínas

provenientes del aparato de Golgi hacia la superficie apical de células, cuando Gal-4 se
encuentra ausente, estas proteínas son acumuladas intracelularmente [138].

También se ha reportado que la Gal-4 participa en el cierre de heridas intestinales, Gal-4 y -

2 exógenas promueven la migración celular mediante la interacción con E-cadherina y -
catenina, estas son importantes para la adhesión, transducción de señales, y morfología
epitelial, además estas dos galectinas no indujeron la apoptosis de células epiteliales a
comparación de Gal-1 que la indujo; en conjunto la capacidad de promover la migración
celular y no inducir la apoptosis proporcionan una homeostasis en el tejido que permite el
cierre de herida [139].

30
La Gal-4 es una proteína necesaria para el adecuado desarrollo neuronal, cuando se
comienzan a definir los axones la Gal-4 se localiza de manera homogénea en ellos, conforme
maduran las neuronas, la Gal-4 se polariza hacia los extremos de los axones. Se ha reportado
que la ausencia de esta retrasa la elongación del axón [140].

Si bien Gal-4 es una proteína que ha sido descrita recientemente, interviene en funciones que
son importantes tanto para el desarrollo de organismos como en el mantenimiento de estos,
ya sea regulando el transporte hacia la membrana y otorgándole estabilidad, como en el
desarrollo de procesos vitales en las neuronas.

1.7.5. La desregulación de la expresión de galectina-4 y cambios asociados al

desarrollo de cáncer

La Gal-4 se ha asociado a varias funciones celulares como proliferación descontrolada,

crecimiento tumoral, adhesión, invasión, migración, metástasis, adhesión a endotelio
vascular entre otras, todas estas funciones se han asociado como características de malignidad
en el desarrollo de cáncer. Aunque no existe un consenso sobre su expresión entre los
diferentes tipos celulares estudiados, en algunos de ellos se ha encontrado que la disminución
o silenciamiento de la expresión de Gal-4 se asocia con un fenotipo más agresivo.

La sobreexpresión de la proteína Gal-4 en diferentes líneas celulares parece tener un efecto

protector. En células de cáncer hepatocelular la sobreexpresión se asoció con una
disminución en su capacidad de invasión y migración [141]. Por otro lado, en células de
cáncer pancreático, PaTu-S que presentaron la mayor expresión tanto de ARN como de
proteína exhibe propiedades migratorias y metastásicas menores. En estas células Gal-4, se
localizó en el citosol, con una mayor presencia en la membrana de células individuales y en
los contactos célula-célula. Las células con alta expresión de Gal-4 tienen menor potencial
de metástasis en xenoinjertos. Se analizó también la secreción de Gal-4 encontrando que es
secretada y luego se une a su superficie celular, esta unión es dependiente de los glicanos, ya
que fue abatida por lavados con lactosa [142].

En células de cáncer hepatocelular la expresión forzada de Gal-4 es capaz de incrementar la

viabilidad y la proliferación celular. Se sugirió que este incremento se debe al aumento de

31
ciclina D1 y la disminución de P21. También se encontró una inhibición de la apoptosis
celular debido a una menor expresión de Bax pro-apoptótica y un incremento de Bcl-2 anti
apoptótica. Gal-4 favorece la adhesión celular ya que incrementa la expresión de E-cadherina
y -catenina en las interacciones célula-célula. Todas las características previamente
mencionadas tienen como consecuencia un mayor crecimiento tumoral, el cual fue
comprobado mediante ensayos in vivo y el marcador de proliferación Ki-67 en los tumores
generados [143].

En células de cáncer colorrectal que sobre expresaban Gal-4 y fueron tratadas con
camptotecina (fármaco usado como anti-proliferativo) se encontró una mayor muerte celular
(apoptosis) respecto a las células que no tenían una sobreexpresión de Gal-4, lo que sugiere
que esta proteína podría funcionar como un sensibilizador para una mejor respuesta al
tratamiento [144].

En una situación contraria, el silenciamiento de Gal-4 en células de cáncer colorrectal

incrementó la proliferación celular y favoreció el crecimiento de tumores en xenoinjertos.
Este silenciamiento resultó en la sobre regulación de NOTCH, TGF-1 y SOX4, también
mejoró la expresión de IL-6 y COX-2 y la fosforilación de Akt lo cual promueve las señales
de supervivencia. Adicionalmente se conoce que IL-6 es un activador de STAT3, NF-B y
Akt que promueve la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [145].

La Gal-4 extracelular favorece la adhesión. En células de cáncer colorrectal que fueron pre-
incubadas con Gal-4 y posteriormente co-cultivadas con endotelio vascular, la adhesión
incrementó respecto a las no pre-incubadas, el aumento en la adhesión se relacionó con el
incremento de la concentración de Gal-4. [146]. Por otro lado, se exploró la capacidad de
adhesión de células de cáncer a glóbulos rojos; se incubaron glóbulos rojos con células
tumorales de cáncer de colón que sobre-expresaban Gal-4, se encontró que Gal-4 favorece la
adhesión de estos tipos celulares, además la morfología de los glóbulos rojos se deforma y
en las células de cáncer colorrectal la Gal-4 se acumuló en la membrana en las zonas de
contacto, este patrón se repitió en células de cáncer de páncreas [147].

32
 1.7.6. Cambios de expresión de galectina-4 en tejido y su asociación con el
desarrollo de cáncer

Como se ha mencionado, la expresión de Gal-4 puede cambiar en procesos tumorales. En lo

que se refiere a pacientes con algún tipo de cáncer se ha encontrado una desregulación en la
expresión de Gal-4, que se asoció con la progresión de la enfermedad.

En pacientes con cáncer colorrectal se examinó la expresión de Gal-4 en tumores y su tejido

adyacente, la expresión del ARNm de Gal-4 se encontró regulada a la baja en procesos de
carcinogénesis [125].

La expresión de Gal-4 en tejido tumoral de pacientes con cáncer hepatocelular incrementó

con respecto al tejido peri tumoral [143, 148]. Se propone que la sobreexpresión de Gal-4
puede incrementar la proliferación e inhibir la apoptosis en tumores primarios de hígado, por
otro lado, en estadios avanzados su menor expresión podría asociarse con recurrencia y
metástasis, por lo que se sugiere como un posible biomarcador pronóstico para este tipo de
cáncer [143]. En pacientes con cáncer hepatocelular que presentaron recurrencia y metástasis
temprana se identificó que tanto el ARNm como la proteína de Gal-4 estaba disminuida
[141]. Adicionalmente, se encontró que esta menor expresión se asoció con tamaños
tumorales ≥ 5, deficiente diferenciación tumoral, invasión microvascular y un TNM más
avanzado. Se identificó la menor expresión de Gal-4 como un factor de mal pronóstico, una
mayor tasa de recurrencia/metástasis, menor tiempo de supervivencia, sugiriendo que Gal-4
puede ser un marcador pronóstico.

La expresión de Gal-4 en tejido de pacientes con cáncer de colon, adenocarcinoma y mucosa

inflamada exhibió niveles más bajos respecto a mucosa normal [145].

En biopsias de pacientes con adenocarcinoma pancreático ductal el 79.3% fueron positivos

para Gal-4, se expresó en los compartimientos citoplasmáticos, membranosos y nuclear. Esta
expresión se asoció con tamaño de tumor y el grado de diferenciación. La expresión se
correlacionó con recurrencia temprana y muerte durante el primer año después de la
resección, Gal-4 se asoció con la supervivencia global a 1 año y los pacientes con expresión
positiva de Gal-4 presentó un mejor tiempo de supervivencia libre de enfermedad. [149], en

33
un análisis con líneas celulares también se identificó a Gal-4, se validó como una diana
específica para terapia [150].

En cáncer gástrico se determinó que Gal-4 se expresa en tejido tumoral a comparación del
tejido no tumoral [151] aunque no se analizó la implicación biológica, en otro estudio,
mediante un análisis de Northern blot en líneas celulares se observó una regulación positiva
de Gal-4 junto con otros genes asociados con diseminación e invasión [152].

Se analizó Gal-4 en muestras de tejidos de pacientes con adenocarcinoma de pulmón y se

mostró que Gal-4 está asociada con características clínico-patológicas como tamaño tumoral,
invasión pleural, estado ganglionar, y estadio TNM, se reveló como un factor independiente
para la metástasis ganglionar y podría servir como un biomarcador para predecir metástasis
a nódulo linfático [153]

En nuestro grupo de trabajo se analizó un microarreglo de expresión en el que se compararon

muestras de tejido con diagnóstico de CaCu y con diagnóstico normal, encontrando una
menor expresión del gen LGALS4 en muestras de CaCu ([154] GSE159976)), este resultado
fue similar cuando se comparó la expresión del gen en líneas celulares de CaCu y tejido de
CCE respecto a muestras normales [132].

1.7.7. Incremento de galectina-4 sérica en cáncer

Gal-4 sérica se ha encontrado en mayor concentración en el suero de pacientes con algunos

tipos de cáncer. Este incremento se ha asociado con el estadio de la enfermedad y con la
progresión de esta, ya que los pacientes con metástasis presentaron concentraciones más
elevadas respecto a los que tuvieron tumores localizados. A continuación, se explican estos
hallazgos.

En cáncer de colon la concentración de Gal-4 sérica incrementó hasta de 11.1 veces, en los
pacientes que presentaron metástasis la concentración incrementó en 25.3. [146, 155]. El
incremento de Gal-4 sérica podría jugar un papel importante en la diseminación de células
tumorales a otros órganos. Los pacientes con altos niveles séricos de Gal-3/-4 presentaron
una menor supervivencia a 10 años [155].

34
Para los pacientes con cáncer de mama Gal-4 sérica tuvo un aumento de 11 veces y se observó
una tendencia de incremento respecto al estadio clínico [146]

Por otro lado, se encontró que los pacientes con cáncer hepatocelular no tienen una diferencia
significativa en la concentración de Gal-4 sérica respecto a los controles, pero en los
pacientes con cáncer que además presentaron infección por virus de hepatitis B (VHB) la
concentración fue mayor. [141].

En el suero de paciente con adenocarcinoma gástrico Gal-4 mostró un incremento de 5.9

veces respecto al control, también evaluaron la capacidad diagnóstica de Gal-4 con un
análisis Roc, en el que encontraron un AUC de 0.924 y el mejor punto de corte de 420 pg/ml,
los pacientes con concentraciones iguales o superiores pueden ser diagnosticados
correctamente con un 62.5% de confianza [156].

Los estudios realizados en suero de pacientes y la implicación clínica que tiene el incremento
de Gal-4 son pocos, pero análisis in vitro han determinado que la Gal-4 circulante podría
estar involucrada en una mayor adhesión de las células de cáncer al endotelio vascular
promoviendo así la angiogénesis y metástasis [102, 157].

35
 2. JUSTIFICACIÓN
El CaCu ocupa el segundo lugar en incidencia y mortalidad de mujeres en México, el método
de tamizaje para la detección de CaCu es el Papanicolaou, que reporta una alta tasa de falsos
negativos, lo que repercute en el diagnóstico tardío de la enfermedad, generando un alto
número de casos en estadios avanzados y una alta tasa de mortalidad. Actualmente no existe
un marcador para este tipo de cáncer que permita dar seguimiento y/o evaluación de la
respuesta al tratamiento de las pacientes. La Gal-4 es una proteína que muestra una expresión
alterada en diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, el aumento en la expresión de la Gal-4
en tejido de pacientes con cáncer colorrectal se asoció con estadios avanzados de la
enfermedad. Respecto al CaCu se desconoce la expresión de esta proteína. Resultados
preliminares de nuestro grupo, generados a partir de un microarreglo de expresión, mostraron
que el gen que codifica para Gal-4 disminuye su expresión en los tumores de CaCu. La
finalidad de este trabajo de investigación es evaluar la expresión de la proteína Gal-4 y su
vinculación con la progresión del CaCu con el fin de aportar evidencias que indiquen si esta
proteína pudiera ser utilizada como un biomarcador de progresión para las pacientes con
CaCu.

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El CaCu representa la segunda causa de muerte por cáncer en la mujer mexicana. La
búsqueda de biomarcadores para el diagnóstico-pronóstico, evaluación de la respuesta al
tratamiento y seguimiento, así como la búsqueda de blancos terapéuticos ha adquirido gran
importancia para este tipo de cáncer. La Gal-4 ha mostrado ser un prometedor marcador de
progresión, metástasis y recurrencia temprana en otros tipos de cáncer. A la fecha se
desconoce si la concentración sérica de Gal-4 se modifica en pacientes con CaCu,
adicionalmente se desconoce si su expresión se modifica en tejido de cérvix durante la
transformación maligna, resultados preliminares del grupo de trabajo muestran una
disminución de los niveles de ARNm en biopsias de CaCu. Por lo anterior en el presente
trabajo se determinará si la concentración sérica y el nivel de expresión en tejido tumoral de
Gal-4 se modifica en las pacientes con CaCu.

36
 4. HIPÓTESIS

⸎ El nivel expresión de la proteína galectina-4 disminuye en tejido de pacientes con

cáncer cervicouterino
⸎ La concentración de galectina-4 incrementa en suero de pacientes con cáncer
cervicouterino
⸎ El incremento de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes se asocia con
características clínico-patológicas
⸎ Galectina-4 sérica es marcador discriminativo de la enfermedad
⸎ El gen de galectina-4 se expresa en líneas celulares de cáncer cervicouterino, teniendo
niveles de ARNm menores que una línea celular no tumoral

5. OBJETIVOS

5.1.Objetivo General

⸎ Evaluar la expresión de galectina-4 en suero y tejido de pacientes con cáncer

cervicouterino e identificar su ARNm en células de cérvix

5.2.Objetivos Específicos

⸎ Determinar la concentración de galectina-4 en el suero de pacientes con cáncer

cervicouterino
⸎ Determinar si la concentración de galectina-4 se relaciona con las características
clínico-patológicas
⸎ Determinar si galectina-4 sérica es un potencial biomarcador diagnóstico
⸎ Identificar la presencia de galectina-4 en biopsias de cérvix
⸎ Cuantificar el nivel de expresión de galectina-4 en biopsias de cáncer cervicouterino
⸎ Determinar si el nivel de expresión de galectina-4 en tejido de cáncer cervicouterino se
relaciona con las características clínico-patológicas
⸎ Evaluar si existe un cambio de localización de galectina-4 en biopsias de pacientes con
cáncer cervicouterino
⸎ Determinar si existe una relación entre la concentración sérica y el nivel de expresión
en tejido de galectina-4
⸎ Identificar y cuantificar el ARNm de galetina-4 en células de cérvix

37
 6. METODOLOGÍA

6.1.Población en estudio

Este estudio se realizó bajo las directrices de la Declaración de Helsinki [158] y el Comité
de Ética e Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). El
proyecto fue registrado en el Comité de Ética e Investigación en Salud contando con el
número de registro R-2016-2106-1.

Las pacientes incluidas en el estudio fueron usuarias del Servicio de Radioterapia del Centro
Médico Nacional Manuel Ávila Camacho, IMSS ubicado en la ciudad de Puebla, México,
durante el periodo comprendido de febrero de 2017 a enero de 2020. Todas las pacientes
incluidas en el estudio firmaron el consentimiento informado (ANEXO II: Consentimiento
informado). A partir de los expedientes clínicos se obtuvo la historia clínica de las pacientes,
así como datos sociodemográficos. El diagnóstico de CaCu fue realizado por el médico
patólogo adscrito al Departamento de Patología y el estadio clínico fue determinado de
acuerdo con los criterios de FIGO [58] por el médico radio-oncólogo. A cada paciente se le
tomó una muestra de sangre previa al tratamiento. En el grupo control se incluyeron mujeres
mayores de 18 años que contaban con un diagnóstico citológico negativo a lesión
intraepitelial escamosa y a malignidad y que aceptaron participar en el estudio firmando la
carta de consentimiento informado.

6.2.Determinación de la concentración de galectina-4 en suero de

pacientes

En el presente estudio fueron procesadas 52 muestras de suero, de las cuales 13

correspondieron al grupo control y 39 al grupo de CaCu. El suero fue obtenido mediante
flebotomía, la muestra de sangre se centrifugó a 3500 rpm por 10 min a temperatura ambiente
y las muestras fueron almacenadas a -20oC hasta su uso. La concentración sérica de Gal-4
fue determinada mediante la técnica de ELISA usando el Human Galectin-4 ELISA Kit
(IRKTAH5118, Innovative Research, Inc., Plymouth, MN, US) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Para los ensayos de ELISA los sueros fueron diluidos 1:2 y para determinar
la concentración de Gal-4 la placa fue leída a una absorbancia de 450 nm en el lector de

38
micro-placa SYNERGY (BioTek Instruments, Inc Winooski, VT, US), la concentración fue
calculada con base en la curva estándar.

6.3.Evaluación de la proteína galectina-4 en tejido cervical

Las biopsias de cérvix embebidas en parafina fueron obtenidas del Departamento de

Patología del Centro Médico Nacional Manuel Ávila Camacho, IMSS. Se procesaron un total
de 35 biopsias de las cuales 6 fueron tejido de cérvix normal y 29 con diagnóstico de CaCu.
A partir de los bloques de parafina se hicieron cortes de 4 m de grosor que fueron colocados
en portaobjetos previamente tratados con APES al 2% (3-Aminopropyltriethoxysilane,
A3648, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, US), posteriormente fueron desparafinadas por 60
min a 60°C, para la hidratación se realizaron 3 baños consecutivos de xilol durante 10 min
cada uno, 3 baños de etanol absoluto por 5 min, 2 baños de etanol al 95% por 5 min, etanol
al 80% por 5 min y un baño de agua. La recuperación antigénica fue realizada en buffer de
citratos 10 mM pH 6.0 (C9999, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, US) por 15 min a 90ºC.
Posteriormente después de cada paso que se realizó a continuación, se hicieron 3 lavados con
buffer de fosfatos (PBS 1X), excepto en la incubación con BSA al 5%. Para el bloqueo de la
actividad de peroxidasa endógena, los cortes se incubaron con 0.3% H2O2 en PBS 1X durante
15 min. Posteriormente para evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario se realizó
un bloqueo con 5% de albúmina sérica bovina (BSA, P6154, Biowest, Riverside, MO, US.)
en PBS 1X, los tejidos fueron incubados toda la noche a 4ºC con el anticuerpo policlonal
anti-Gal4 (ab170638, Abcam, Cambridge, UK) diluido 1:100 en solución de BSA al 5% en
PBS 1X. Posteriormente los tejidos fueron incubados con el anticuerpo secundario anti-
conejo IgG-HRP (ab6721, Abcam, Cambridge, UK) diluido 1:1000 en solución de BSA al
5% en PBS 1X; finalmente la reacción colorimétrica se realizó empleando el kit ImmPACT®
DAB Peroxidase Substrate (SK-4105, Vector Labs, Burlingame, CA, US), siguiendo las
recomendaciones del fabricante, el tiempo de incubación correspondió a 10 seg. La tinción
de núcleos se realizó incubando por 10 seg con una solución de hematoxilina (HX87960674
Merck, Darmstadt, Hesse, DE), se lavaron con agua corriente. Los cortes fueron montados
con el medio VectaMount® Permanent Mounting Medium (H-5000, Vector Labs,
Burlingame, CA, UU). Los controles negativos fueron procesados de igual manera que los
experimentales, excluyendo únicamente la incubación con el anticuerpo primario.

39
Las imágenes de cada muestra fueron tomadas con el sistema de captura VENTANA DP200
scanner (Roche Diagnostics, Switzerlands, CH). Posteriormente para llevar a cabo la
cuantificación de la intensidad de coloración de las muestras, se tomaron 4 fotografías en
áreas correspondientes al diagnóstico histopatológico, para cada fotografía se realizó la
cuantificación de 5 campos, finalmente para obtener la densidad media de coloración
(lúmenes) para cada muestra, los valores en lúmenes de las 4 fotografías se promediaron. La
intensidad de coloración fue evaluada con Image-Pro software (Media Cybernetics, Inc.,
Rockville, MD, US).

6.4.Localización de la galectina-4 en tejido cervical por

inmunofluorescencia

A partir de los bloques de parafina se hicieron cortes de 4 µm de grosor que fueron colocados
en portaobjetos previamente tratados con APES, posteriormente fueron desparafinadas por
60 min a 60 °C, la hidratación y recuperación antigénica se realizó como se mencionó.

Se realizó la permeabilización de la membrana con una solución de 0.2% Tritón X-100

(T8787 Sigma Aldrich, St. Louis, MO, US) en PBS 1X. Para evitar la unión inespecífica del
anticuerpo primario se realizó un bloqueo con 1% de BSA (P6154, Biowest, Riverside, MO,
US.) en PBS 1X por 2 hrs, posteriormente los tejidos fueron incubados toda la noche a 4ºC
con el anticuerpo policlonal anti-Gal4 (ab170638, Abcam, Cambridge, UK) diluido 1:100 en
solución 1% de BSA en PBS 1X. Después los tejidos fueron incubados con el anticuerpo
secundario anti-conejo IgG H&L (Alexa Fluor 488) (ab150077, Abcam, Cambridge, UK)
diluido 1:1000 en solución 1% de BSA en PBS 1X. La tinción de núcleos se realizó
incubando con DAPI 0.1 µg/ml (4883S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, US), por
50 seg. Los cortes fueron montados con el medio VectaShield® Antifade Mounting Medium
(H-1000, Vector Labs, Burlingame, CA, US), las laminillas fueron almacenadas a 4°C
protegidas de la luz. Los controles negativos fueron procesados de igual manera que los
experimentales, excluyendo únicamente la incubación con el anticuerpo primario. Las
microfotografías fueron tomadas con un microscopio Axio Observed.Z1 ZEISS PALM
MicroBeam (Carl Zeiss, Oberkochen, Baden-Württemberg, DE) acondicionado con el
sistema Apotome, se usaron los objetivos 10X y 20X, la longitud de onda de excitación fue

40
de 390-420 y de 455-495 para DAPI y Alexa Flour 488 respectivamente. Las imágenes
fueron analizadas con el programa ZEN (blue edition) versión 10.0 (Carl Zeiss, Oberkochen,
Baden-Württemberg, DE).

6.5.Características de las líneas celulares y su mantenimiento

Las líneas celulares usadas en el desarrollo experimental fueron SiHa (HTB-35, ATCC,
Manassas, VA, US.), HeLa (CCL-2, ATCC, Manassas, VA, US.), CasKi (CRL-1550,
ATCC, Manassas, VA, US.), C33-A (HTB-31, ATCC, Manassas, VA, US.), que
corresponden a células derivadas de tumores de cérvix, la línea celular Jurkat (TIB-152,
ATCC, Manassas, VA, US.) que corresponde a linfocitos-T de una leucemia linfoblástica
aguda y HaCaT que son queratinocitos inmortalizados de piel (donados por Dra. Adriana
Aguilar Lemarroy del banco de células del Centro de Investigación Biomédica de Occidente)
Las células Jurkat y las HaCaT fueron usadas como controles (Tabla 4).

Las líneas celulares SiHa, HeLa, C33-A y HaCaT fueron mantenidas en medio de cultivo
DMEM (P0103, Biowest, Riverside, MO, US.), Caski y Jurkat en RPMI (P0860, Biowest,
Riverside, MO, US.), suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB, S1560, Biowest,
Riverside, MO, US.), antibiótico-antimicótico (L0010, Biowest, Riverside, MO, US.) en
botellas de cultivo T-25 (90025, TPP, Zollstrasse, Trasadingen, CH), los subcultivos se
realizaron disociando la monocapa de células con 300 uL de tripsina-EDTA 1X (L0930-500,
Biowest, Riverside, MO, US.) e incubando a 37ºC por 5 min, posteriormente se colectaron y
centrifugaron a 1500 RPM por 5 min, se lavaron dos veces con PBS 1X, se re-suspendieron
en 1 ml de medio y se hizo un pase con 200 µl de células, manteniéndose a 37ºC, en atmósfera
húmeda y 5% de CO2. Las células Jurkat crecen en suspensión por lo que se tomaron los 5
ml de medio de cultivo y se centrifugaron a 1500 RPM por 5 min, se lavaron con PBS 1X y
se sembraron 1 millón de células para mantenimiento del cultivo.

Tabla 4. Características de las líneas celulares.

Origen celular Genotipo de VPH

HaCat Queratinocitos de piel neg
Caski Carcinoma de células escamosas de cérvix 16

41
 SiHa Carcinoma de células escamosas de cérvix 16
C33-A Carcinoma de células escamosas de cérvix neg
HeLa Adenocarcinoma 18
Jurkat Linfocitos T de leucemia linfoide aguda neg

6.6.Cuantificación de la expresión del gen LGALS4 en líneas celulares por

PCR en tiempo real

Para la extracción del ARN total y posterior cuantificación del gen LGALS4 las líneas
celulares fueron cultivadas hasta el 80 % de confluencia en placas de cultivo P100 (430167,
Corning, NY, US.), para su disociación de la monocapa las células fueron incubadas con 500
l de tripsina EDTA 1X (L0930-500, Biowest, Riverside, MO, US.) durante 5 min a 37ºC,
centrifugadas a 1500 rpm, posteriormente fueron lavadas con PBS 1X. La extracción de ARN
mensajero (ARNm) se realizó usando el Kit Nucleospin RNA (740955.50, Macherey-Nagel,
Bethlehem, PA, US.) siguiendo las instrucciones del fabricante, para eluir el ARN total de la
columna se usaron 30 l de agua libre de nucleasas. Posteriormente para eliminar cualquier
resto de ADN contaminante, 3 g de ARN total fueron incubados con ADNasa, usando el kit
(DNase I, RNase-free, EN0523, Waltham, MA, USA), finalmente se determinó la
concentración y pureza del ARN en el equipo Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, US), la concentración se determinó a partir dela lectura a 260 nm y la pureza se
determinó obteniendo la relación de 260/280 nm, considerando una adecuada pureza de la
muestras cuando presentaba un valor cercano a 2.0. Para determinar la integridad de ARN
total se realizó una electroforesis de agarosa al 0.8 % (V3121, Promega, Madison, WI, US)
y se corrió a 70 V por 1 hr.

La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó con el kit Thermo Scientific

RevertAid RT, (K1691, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) usando 2 g de ARN
total, y empleando oligonucleótidos dT. Para verificar que la síntesis del ADNc se realizó un
PCR punto final amplificando el gen de ciclofilina (Tabla 5).

Para cuantificar la expresión del gen LGALS4 se realizó un análisis de expresión relativa
mediante un PCR tiempo real, usando los oligonucleótidos reportados previamente por Cai
[141] (Tabla 5). El gen endógeno que se usó para validar el método fue hipoxantina-guanina

42
fosforibosiltransferasa (HPRT) (Tabla 5). Para determinar la eficiencia de amplificación se
realizó una curva de concentraciones de 5, 2.5, 1.25, 0.625 y 0.312 ng/µl de ARN total.
Considerando los valores obtenidos en la curva de concentración, los ensayos de
cuantificación relativa se realizaron usando 5 ng/l para cada una de las líneas celulares y el
programa de amplificación fue 40 ciclos de 95ºC por 30 seg y 55º por 1 min. La cuantificación
de la expresión se realizó con el método ΔΔCt mediante la fórmula 2-ΔΔCT.

Tabla 5. Secuencia de oligonucleótidos y su tamaño de amplificación

Gen Oligonucleotido sentido Oligonuleotido antisentido Producto

Ciclofilina 5’-ATG GTC AAC CCC ACC GTG TT-3’ 5’CGT GTG AAG TCA CCA CCC-3’ 150 pb
LGALS4 5’-CCC TTC TAT GAG TAC GGG CAC-3’ 5’-TGG CCT CCG ATG AAG TTG ATT-3’ 101 pb
HPRT 5’-CCT GGC GTC GTG ATT AGT GAT GAT-3’ 5’-CGA GCA AGA CGT TCA GTC CTG TC-3’ 136 pb

6.7.Cuantificación de la proteína galectina-4 en líneas celulares por

Western Blot

La detección de Gal-4 en líneas celulares se llevó a cabo con un Western Blot (WB). A partir
de un cultivo de células en placas p100 (430167, Corning, NY, US.) al 80% de confluencia
se colectó el pellet celular como anteriormente se describió, se re-suspendió en 100 l de
buffer RIPA frío (Tris HCl pH 7.4 50 mM, NP-40 1%, deoxicolato de sodio 0.5%, SDS 0.1%,
cloruro de sodio 150 mM, EDTA 2 mM) adicionado con inhibidor de proteasas (78430,
Thermo Scientific, Waltham, MA, US), se realizó la extracción de proteínas totales
incubando 60 min en hielo mezclando en vórtex por 1 min cada 10 min hasta completar el
tiempo, finalmente se centrifugó a 14,000 g durante 15 min a 4ºC, se recuperó el sobrenadante
y se desechó el pellet. La cuantificación de proteínas totales se realizó con el kit DC Protein
Assay (BioRad, Hercules, CA, US), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial.

Para los ensayos de WB, 100 g de proteína fue sometida a electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12 % SDS-PAGE, la sección concentradora del gel que se preparó al 5%
de poliacrilamida se corrió a 70 V por 20 min, posteriormente el gel separador se corrió a
120 V por 130 min, al término de la electroforesis la proteína fue transferida a una membrana

43
PVDF de 0.2 m (1620177, BioRad, Hercules, CA, US) en cámara húmeda por 16 hrs a 90
mA. La membrana fue bloqueada con BSA al 5% en PBS 1X (BSA, P6154, Biowest,
Riverside, MO, US.) por 2 hr. Posteriormente la membrana fue incubada durante toda la
noche a 4ºC, con el anticuerpo policlonal anti-Gal4 (ab170638, Abcam, Cambridge, UK) en
una dilución de 1:100 en una solución de BSA al 5% en PBS 1X, posteriormente se incubó
con el anticuerpo secundario anti-conejo IgG-HRP (ab6721, Abcam, Cambridge, UK) en una
dilución de 1:1,000 en una solución de BSA al 5% en PBS 1X. Como control de carga de
proteína fue utilizada la proteína β-actina, para su detección se utilizó el anticuerpo anti--
actina (ab8224, Abcam, Cambridge, UK). Los controles de inespecificidad fueron
procesados únicamente con el anticuerpo secundario.

La detección de Gal-4 y β-actina fue realizada a través de un ensayo de quimioluminiscencia

(WBKLS0500, Millipore, Darmstadt, DE); la membrana se incubó por 5 min en la solución
del kit y posteriormente se reveló por 6 min en el equipo C- Digit Blot Scanner (LI-COR
Biosciences, Lincoln, NE, US). La densidad de las bandas fue procesada con el software
Image Studio 5 Lite (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, US). La densidad de las bandas de
β-actina fue utilizada para normalizar las densidades obtenidas para Gal-4.

6.8.Evaluación de la expresión y localización de la galectina-4 en líneas

celulares por inmunofluorescencia

Para el análisis de expresión de galectina 4 en las líneas celulares SiHa y HaCat fueron
sembradas 50,000 células por pozo en cámaras de cultivo de 8 pozos Nunc™ Lab-Tek™
Chamber Slide System (177402, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US), se incubaron
por 24 hrs, posteriormente las células fueron lavadas 3 veces con PBS 1X y se fijaron con
formaldehído al 4 % en PBS 1X por 15 min a temperatura ambiente. Las células fueron
permeabilizadas con una solución de 0.2% Tritón X-100 (T8787 Sigma Aldrich, St. Louis,
MO, US) en PBS 1X, se realizaron 5 lavados con PBS 1X frío por 5 min cada uno.
Posteriormente para evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario se realizó un bloqueo
con 1% de BSA (P6154, Biowest, Riverside, MO, US.) en PBS 1X por 1 hr. Las células
fueron incubadas toda la noche a 4ºC con el anticuerpo policlonal anti-Gal4 (ab170638,
Abcam, Cambridge, UK) diluido 1:100 en solución 1% de BSA en PBS 1X, se realizaron 5

44
lavados con PBS 1X. Después fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-conejo
IgG H&L (Alexa Fluor 488) (ab150077, Abcam, Cambridge, UK) dilución 1:500 en 1% de
BSA en PBS 1X por 1.5 hrs a temperatura ambiente protegido de la luz. Se realizaron 5
lavados con PBS 1X y se procedió a la tinción de núcleos incubando con DAPI 0.1 µg/ml
(4883S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, US), por 50 seg. Las laminillas fueron
montadas con el medio VectaShield® Antifade Mounting Medium (H-1000, Vector Labs,
Burlingame, CA, US) y almacenadas a 4°C protegidas de la luz. Los controles negativos
fueron procesados de igual manera que los experimentales, excluyendo únicamente la
incubación con el anticuerpo primario. Las microfotografías fueron tomadas con un
microscopio Axio Observed.Z1 ZEISS PALM MicroBeam (Carl Zeiss, Oberkochen, Baden-
Württemberg, DE) acondicionado con el sistema Apotome, se usó el objetivo de inmersión
63X, la longitud de onda de excitación fue de 390-420 y de 455-495 para DAPI y Alexa Flour
488 respectivamente. Las imágenes fueron procesadas con el programa ZEN (blue edition)
versión 10.0 (Carl Zeiss, Oberkochen, Baden-Württemberg, DE).

6.9.Análisis estadístico

Los análisis estadísticos fueron hechos usando el programa GraphPad Prism 8 (GraphPad
Software, San Diego, CA, US). En la sección de paciente la diferencia de la concentración
sérica de Gal-4 entre grupos se determinó mediante la prueba estadística de Mann-Whitney.
La asociación entre la concentración de Gal-4 sérica y cada una de las características clínico-
patológicas fue determinada con el análisis Mann-Whitney, cuando se compararon tres o más
características o grupos se empleó la prueba de Kruskal Wallis con un post análisis de
Dunn´s. La diferencia en intensidad de tinción de Gal-4 en los tejidos de pacientes fue
evaluada con el análisis Mann-Whitney.

Para determinar la capacidad de Gal-4 sérica de ser un biomarcador diagnóstico se realizó un

análisis de la curva ROC (Receiver-operating characteristic). Las curvas ROC son útiles en
las primeras etapas de la evaluación de una nueva prueba diagnóstica, las curvas ROC no
varían con respecto a la prevalencia de la enfermedad, pero depende las características del
paciente y la enfermedad, proporcionan la precisión diagnóstica de la prueba y la
identificación de los puntos de corte óptimos. Un área bajo la curva (AUC) de 1 refleja una

45
prueba perfectamente precisa [159, 160]. Un AUC de 0.5 indica que no hay discriminación,
de 0.7 a 0.8 es considerada aceptable, de 0.8 a 0.9 es excelente y más de 0.9 es sobresaliente
[161]. El mejor punto de corte fue hecho con el índice Youden (J) [162] el cual permite dar
el mismo peso a la sensibilidad y a la especificidad y determinar la concentración de Gal-4
sérica para distinguir entre pacientes enfermos y sanos. El índice se calcula con la diferencia
entre la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (1-
especificidad) [163].

Para la sección de experimentos in vitro la diferencia del nivel de expresión del gen LGALS4
y la cuantificación de la proteína Gal-4 por WB en las líneas celulares se analizó con un
ANOVA de dos vías y post-análisis de Dunn´s.

Para todos los análisis estadísticos un valor de p<0.05 fue considerado como una diferencia
estadísticamente significativa.

46
 7. RESULTADOS

7.1.Características de la población de estudio

En este estudio fueron incluidas muestras de suero y/o tejido de pacientes con CaCu y de
mujeres con citología negativa a lesión intraepitelial escamosa y a malignidad. Las muestras
de tejido fueron diagnosticadas por un patólogo y el estadio fue determinado por el médico
tratante y/o el patólogo, en función del estadio clínico. Se incluyeron mujeres mayores de 18
años. Para el grupo control las mujeres debían contar con un reporte de citología negativo a
malignidad menor a 1 año y para el caso de las pacientes con CaCu se incluyeron mujeres
mayores de 18 años, sin antecedentes de otro tipo de cáncer, y que no hubieran recibido
tratamiento previo.

7.1.1. Características sociodemográficas de las pacientes con cáncer con

procesamiento de galectina-4 sérica

Se incluyeron 52 muestras séricas, la media de edad de la población total fue de 50 años

(±15.58 (SD)), la media de edad de las mujeres del grupo control fue de 32.92 años (
(SD)) y del grupo con CaCu de 55.26 años ( (SD)).

Se realizó un análisis de las características sociodemográficas de las pacientes con cáncer los
resultados se muestran en la Tabla 6. Cabe resaltar que más del 40% de las pacientes tienen
una escolaridad baja o no tienen estudios, el tabaquismo y alcoholismo no presentaron
prevalencia. Los riesgos asociados al desarrollo de CaCu como el comportamiento sexual
fueron analizados en la población de estudio, el 12.82% iniciaron su vida sexual antes de los
16 años y el 58.97% reportaron una única pareja sexual, por lo que estos factores de riesgo
no parecen ser determinantes en nuestra población. En cuanto al número de hijos el 25.64%
tienen menos de 3 hijos, siendo de llamar la atención que el 51.28% de las pacientes tienen
más de tres hijos, lo que resalta que el número de embarazos representa un factor de riesgo
prevalente en nuestra población. El 15.38% negó haber usado un método de planificación
familiar, mientras que el 15.38% usó un método hormonal, el 12.82% utilizó el DIU y el
7.69% la salpingoclasia.

47
Tabla 6. Características sociodemográficas y ginecológicas de las pacientes con CaCu y suero procesado.

Característica n Porcentaje
Escolaridad
Sin estudios 1 2.56
Básica 15 38.46
Media Superior 1 2.56
Superior 6 15.38
Sin datos 16 41.03
Ocupación
Labores del hogar 20 51.28
Empleada/obrera 7 17.95
Administrativas 4 10.26
Sin datos 8 20.51
Tabaquismo
No 17 43.59
Si 8 20.51
Sin datos 14 35.90
Exfumadoras
Exfumadora >10 años 3 7.69
Exfumadora <10 años 7 17.94
Niega ser exfumadora 18 46.15
Sin datos 11 28.21
Alcoholismo
No 20 51.28
Si 4 10.26
Sin datos 15 38.46
Inicio de menstruación
< 12 años 15 38.46
> 12 años 16 41.03
Sin datos 8 20.51
Inicio de vida sexual
≤ 16 años 5 12.82
> 16 años 24 61.54
Sin datos 9 23.08
No. de parejas sexuales
1 23 58.97
>1 7 17.95
Sin datos 9 23.08
Número de hijos
Ninguno 1 2.56
1-3 10 25.64
>3 20 51.28
Sin datos 8 20.51
Abortos
No 21 53.85
Si 10 25.64

48
 Sin datos 8 20.51
Menopausia
No 4 10.25
Si 21 53.84
Sin datos 14 20.51
Método de planificación familiar
Hormonal 6 15.38
Salpingoclasia 3 7.69
DIU 5 12.82
Ninguno 6 15.38
Sin datos 19 48.72

7.1.2. Características de las pacientes a las que se evaluó la expresión en tejido de

galectina-4

Se incluyeron 35 biopsias de tejido de pacientes, 6 con diagnóstico normal y 29 con

diagnóstico de CaCu. El grupo de pacientes con CaCu tienen una media de edad de 54.69
años (±11.56 (SD)) y una mediana de 52 años (rango 37-80). Respecto a las características
sociodemográficas del grupo de CaCu), el 50% tienen educación básica, el tabaquismo y
alcoholismo no presentaron prevalencia (Tabla 7). En cuanto a las características gineco-
obstétricas: la mayoría de la población inició su vida sexual después de los 16 años y más del
60% reportaron una única pareja sexual. El método de planificación familiar de mayor uso
fue el DIU 24.14%, luego el hormonal con 20.69% y la salpingoclasia con el 10.34%, estas
características no representan un factor de riesgo respecto a lo reportado previamente.

Tabla 7 Características de las pacientes con CaCu y estudio en biopsia

Característica n Porcentaje
Escolaridad
Básica 16 55.17
Media Superior 2 6.90
Superior 6 20.69
Sin datos 5
Ocupación
Labores del hogar 20 68.97
Empleada/obrera 6 20.69
Administrativas 1 3.45

49
Comerciante 2 6.90
Tabaquismo
No 21 72.41
Si 5 17.24
Sin datos 3 10.34
Exfumadora
>10 años 2 6.90
Negado 23 79.31
Sin datos 4
Alcoholismo
No 23 79.31
Si 2 6.90
Sin datos 4
Inicio de menstruación
< 12 años 7 24.14
> 12 años 22 75.86
Inicio de vida sexual
≤ 16 años 9 31.03
> 16 años 20 68.97
No. de parejas sexuales
1 20 68.97
>1 9 31.03
Número de hijos
1-3 12 41.38
>3 17 58.62
Abortos
No 13 44.83
Si 16 55.17
Menopausia
No 10 34.48
Si 19 65.52
Método de planificación familiar
Hormonal 6 20.69
OTB 3 10.34
DIU 7 24.14
Ninguno 7 24.14
Sin datos 6

50
 7.2.Concentración de galectina-4 en suero de pacientes con cáncer
cervicouterino

Las 52 muestras se agruparon en mujeres con reporte citológico normal que conformaron el
grupo control (n=13) y con CaCu (n=39). La mediana de la concentración de Gal-4 sérica en
el grupo control fue de 382.14 pg/ml, mientras que en el grupo con CaCu fue de 507.08
pg/ml. El incremento en la concentración en el grupo de mujeres con cáncer fue
estadísticamente significativo (p=0.0061) (Figura 7).

3000 **
Concentración de Galectina-4 (pg/ml)

2000

1000

Control CaCu

Figura 7. La concentración de Gal-4 sérica en mujeres con citología normal y mujeres con CaCu. Se muestra
la concentración de Gal-4 (pg/ml) en suero de pacientes control ( n= 13), y con CaCu ( n= 39). Análisis
de Mann-Whitney ** p=0.0061.

51
 7.2.1. Análisis de la concentración de galectina-4 sérica y las características clínico-
patológicas en pacientes con cáncer cervicouterino

Las pacientes con CaCu tienen características histológicas y clínicas importantes que se
relacionan con el pronóstico y con la respuesta al tratamiento. Por esta razón nos interesó
evaluar si existía una asociación entre la concentración de Gal-4 en suero con respecto al tipo
histológico, la estadificación FIGO y el tamaño del tumor.

Tabla 8. Niveles séricos de Gal-4 y características clínico-patológicas.

Gal-4 en suero (pg/ml)

Cáncer cervicouterino n Valor de pa
Media (SD) Mediana Rango
Tipo Histológico
Carcinoma Escamoso 32 878.23 (517.17) 757.06 141.13-2518.00 0.0949
Adenocarcinoma 7 563.39 (389.59) 493.63 149.88-1388.00
Estadificación FIGO
I-II 17 625.39 (423.48) 563.63 141.13-1462.14 0.1997
III-IV 10 779.65 (321.39) 681.99 453.63-1356.42
No clasificable 12
Tamaño de tumor en su máxima extensión (cm)
≤5.1 8 815.63 (531.37) 613.15 198.63-1636.43 0.1325
>5.1 6 395.42 (206.99) 448.63 141.13-647.86
Sin tamaño 24
a valor de p fue calculada con un análisis Mann-Whitney.

Encontramos que los valores de la concentración la Gal-4 en suero del grupo de las pacientes
con carcinoma escamoso no presentaron diferencia significativa con los valores del grupo de
las pacientes con adenocarcinoma (Tabla 8) Pero podemos observar que el grupo de las
pacientes con carcinoma escamoso mostró una mediana mayor que el que presenta el grupo
de las pacientes con adenocarcinoma (Figura 8). Con relación al estadio clínico, encontramos
que los valores de la concentración la Gal-4 en suero del grupo de las pacientes con estadios
I-II no presentaron diferencia significativa con los valores del grupo de las pacientes con
estadios III-IV, pero se puede observar que el grupo de las pacientes con estadios III y IV
mostró una mediana mayor que el que presenta el grupo de las pacientes con estadios I y II
(Figura 9). Por otra parte, encontramos que los valores de la concentración la Gal-4 en suero
del grupo de las pacientes con un tamaño de tumor menor o igual a 5.1 centímetros no

52
presentaron diferencia significativa con los valores del grupo de las pacientes con un tamaño
de tumor mayor a 5.1 centímetros, pero podemos observar que el grupo de las pacientes con
un tamaño de tumor menor o igual a 5 centímetros mostró un promedio mayor que el que
presenta el grupo de las pacientes con un tamaño de tumor mayor a 5.1 centímetros (Figura
10).

Niveles séricos de galectina-4 por tipo histológico

ns
Concentración de Galectina-4 (pg/ml)

3000

2000

1000

Carcinoma escamoso Adenocarcinoma

Figura 8. Niveles séricos de Gal-4 en pacientes con CaCu por tipo histológico p=0.0949.

Niveles séricos de galectina-4 por estadio clínico

2000 ns
Concentración de Galectina-4 (pg/ml)

1500

1000

500

I-II III-IV
Figura 9. Niveles séricos de Gal-4 por estadio clínico p=0.1997.

53
 Figura 10. Niveles séricos de Gal-4 con respecto al tamaño de tumor p=0.1325.

Adicionalmente en el tipo histológico de carcinoma escamoso se analizó sí existía alguna

relación entre la concentración de Gal-4 y las características clínico-patológicas como grado
de diferenciación, estadio clínico, tamaño tumoral, tipos queratinizante y no queratinizante
(Tabla 9), no se realizó este análisis para adenocarcinoma ya que el grupo estuvo conformado
sólo por 7 muestras.

Observamos una tendencia a la disminución de la concentración de Gal-4 conforme el tumor

se va desdiferenciando, puesto que la mediana de la concentración de los pacientes con
tumores bien diferenciados fue de 1813.00 pg/ml, la mediana de la concentración de los
pacientes con tumores moderadamente diferenciados fue de 672.14 pg/ml, mientras que la
mediana de los pacientes con tumores pobremente diferenciados fue de 507.86 pg/ml. Por
otro lado, encontramos que la mediana de la concentración sérica de los estadios I-II fue de
564.31 pg/ml, y en los estadios clínicos III-IV fue de 716.13 pg/ml, observando una tendencia
al incremento conforme avanza el estadio, sin embargo, no encontramos diferencias
estadísticamente significativas. Con respecto al tamaño de tumor no encontramos diferencias
estadísticamente significativas, pero observamos que existe una tendencia al decremento de
la concentración sérica con respecto al incremento al tamaño del tumor, puesto que
obtuvimos una mediana de 917.86 pg/ml de las pacientes con tumores de ≤5.1 cm, mientras

54
que obtuvimos una mediana de 448.63 pg/ml del grupo de pacientes con tumores >5.1 cm.
El análisis de la concentración sérica realizado entre los tumores queratinizantes y no
queratinizantes no presentó diferencias estadísticamente significativas.

Tabla 9. Niveles séricos de Gal-4 en pacientes con carcinoma escamoso y características clínico-patológicas.

Gal-4 en suero (pg/ml)

n Media (SD) Mediana Rango Valor de pa
Diferenciación
Pobre 5 612.01 (317.89) 507.86 448.63-1139.29 Pobre vs moderada >0.9999a
Moderada 16 755.44 (391.97) 672.14 198.63-1636.43 Moderada vs bien 0.2625a
Bien 2 1813.00 (997.02) 1813.00 NA Bien vs pobre 0.1390a
No reportado 9
Queratinización
No 13 733.84 (384.90) 696.43 141.13-1462.14 0.8960b
Si 9 810.51 (404.66) 716.13 381.13-1478.00
No reportado 10
Estadificación FIGO
I-II 14 681.60 (441.16) 564.31 141.13-1636.43 0.3280b
III-IV 9 806.67 (328.62) 716.13 453.63-1356.42
No clasificable 9
Tamaño de tumor en su máxima extensión (cm)
≤5.1 6 943.80 (561.15) 917.86 529.88-1636.43 0.1048b
>5.1 4 421.56 (209.22) 448.63 141.13-647.86
Sin tamaño 29
avalor de p fue calculada con Kruskal Wallis y post análisis de Dunn´s, b p-value fue calculada con un análisis Mann-
Whitney.

7.2.2. Galectina-4 sérica como marcador diagnóstico en pacientes con cáncer

cervicouterino

Para evaluar si Gal-4 sérica podría ser una proteína candidata para biomarcador diagnóstico,
que permitiera diferenciar entre pacientes con CaCu y mujeres con citología normal, se
realizó un análisis ROC (Receiver-operating characteristic) considerando las
concentraciones séricas de ambos grupos. La gráfica que se generó muestra el equilibrio entre
la sensibilidad (detectar pacientes enfermos) y la especificidad (detectar la ausencia de la
enfermedad). El área bajo la curva ROC para la Gal-4 sérica fue de 0.7515 con una
significancia de p=0.0071, con un 95% de intervalo de confianza 0.5900 a 0.9129, error
estándar de 0.0823. En la Figura 11 se muestra la curva ROC de Gal-4 sérica, el valor de

55
corte (índice Youden) fue de 432.14 pg/ml. Considerando este valor de corte se detectan el
82.1% de verdaderos positivos (pacientes con CaCu) y una especificidad del 69.2%
(verdaderos negativos), obteniendo un 30.8% de falsos positivos.

1.0
Gal-4

0.8
Sensibilidad

0.6

0.4

0.2

0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1 - Especificidad

Figura 11. Curva ROC de la concentración sérica de Gal-4 de pacientes con CaCu. La gráfica muestra un
área bajo la curva de 0.7515, p=0.0071, 0.5900 a 0.9129 de 95% de intervalo de confianza, error estándar
de 0.0823.

56
 7.3. Expresión de galectina-4 en tejido de pacientes con cáncer
cervicouterino

7.3.1. Expresión de galectina-4 en epitelio escamoso

La expresión de la Gal-4 no había sido reportada en tejido de cérvix, así que nuestro primer
interés fue determinar si estaba presente en epitelio cervical, por lo que en primera instancia
realizamos ensayos inmunohistoquímicos en epitelio de tejido normal. Se utilizaron 6
muestras de pacientes con diagnóstico normal y 29 con CaCu (23 diagnosticadas con CEE,
5 con adenocarcinoma y 1 con carcinoma adenoescamoso).

Los resultados mostraron la presencia de la proteína Gal-4 tanto en epitelio normal como en
el tejido de pacientes. El patrón de expresión en epitelio cervical normal mostró diferencias
en cuanto a los estratos del epitelio. Al respecto, encontramos que las células de la lámina
basal no mostraron presencia de Gal-4, sin embargo, ésta fue detectada en las células
diferenciadas de las láminas parabasales, intermedia y superficial, con una expresión
predominante en la lámina superficial. Además, observamos la expresión de Gal-4 en las
células del estroma. A nivel celular observamos que la expresión de Gal-4 se encuentra
localizada principalmente en el citoplasma de las células, (Figura 12A y Figura 12B).

También encontramos que el patrón de expresión de la Gal-4 en los tejidos de CCE, fue
diferente al del tejido normal. Observamos que los niveles de expresión de la Gal-4 fueron
mayores en algunas biopsias de tumores con respecto al tejido normal, y que su presencia no
se limitó al citoplasma, mostrando una importante expresión en el núcleo de las células
tumorales (Figura 12C y Figura 12D). Al igual que en tejido normal se observó la presencia
de Gal-4 en el estroma.

57
 Figura 12. Inmonudetección de Gal-4 en epitelio escamoso de tejido normal y con CaCu. En el epitelio
normal (A y B) la expresión de Gal-4 se encontró en el citoplasma de las células, mientras que en tejido
tumoral (C y D) la expresión de Gal-4 se encontró tanto en citoplasma como en núcleo. Las fotos se tomaron
en una amplificación de 20X y 40X.

Con la finalidad de determinar si el nivel de expresión de Gal-4 se modificaba en relación

con las características clínico-patológicas, evaluamos los niveles de expresión con respecto
al estadio clínico, el tipo histológico, el grado de diferenciación del tumor y si éste era de
tipo queratinizante o no queratinizante (Tabla 10). Encontramos que los tumores
queratinizantes mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Gal-
4 respecto a los no queratinizantes (Figura 13 y Tabla 10). Se encontró una tendencia de
incremento en la expresión de Gal-4 en los tumores correspondientes a estadios avanzados
de la enfermedad, sin embargo, no encontramos diferencias estadísticamente significativas
(Figura 12).

58
 Tabla 10. Nivel de expresión de Gal-4 en tejido y características clínico-patológicas de pacientes con CaCu

Niveles de expresión de Gal-4 (lum)

Cáncer cervicouterino n Valor de pa
Mediana Rango
Tipo histológico
Carcinoma escamoso 23 72.216 4.129-151.793 Carcinoma escamoso vs
Adenocarcinoma 5 61.985 11.779-90.595 Adenocarcinoma
Carcinoma adenoescamoso 1 22.053 NA 0.3272
Diferenciación
Pobre 2 80.560 NA Pobre vs moderada 0.6403
Moderada 21 71.028 4.129-151.793
Bien 1 90.575 NA
No reportado 5
Queratinizante
No 16 62.226 4.129-129.247 0.0318
Si 5 102.896 55.008-110.984
No reportado 8
Estadificación FIGO
I-II 16 57.434 4.129-151.793 0.1868
III-IV 9 78.020 19.747-120.247
No clasificable 4
Tamaño de tumor (cm)
≤5.1 9 61.985 4.129-90.575 0.1797
>5.1 10 62.115 9.532-77.060
Sin tamaño 10
a valor de p fue calculado con el análisis Mann-Whitney.

Expresión de galectina-4 en tumores queratinizantes

y no queratinizantes

200

150
Densidad media (lum)

100

50

No Sí
Queratinizante

59
 Figura 13. Expresión de Gal-4 en tejidos respecto a queratinización. Expresión de Gal-4 en tumores
queratinizantes (n=16) y no queratinizantes (■ n=5). Los niveles de expresión de Gal-4 en tumores fue
mayor que en los que no presentan queratina, La media de la intensidad de la expresión de Gal-4 fue
calculada con el programa Image-Pro. Análisis Mann-Whitney * p=0.0318.

Expresión de galectina-4 por estadio clínico

200

150
Densidad media (lum)

100

50

I-II III-IV

Figura 14. Expresión de Gal-4 respecto a estadio FIGO. Se muestra la expresión de Gal-4 en tumores de
pacientes con estadios FIGO I-II (● n=16) y III-IV (■ n=9). En estadios tempranos (I-II) se observó un
menor nivel de expresión de Gal-4, con respecto a los estadios tardíos (III-IV). La media de intensidad de
coloración en las biopsias se obtuvo con el programa Image-Pro. El análisis Mann-Whitney no mostró
diferencias significativas (p=0.1868).

Posteriormente evaluamos la expresión de Gal-4 con relación al estadio clínico en tumores

con diagnóstico histológico de CEE. La expresión de la Gal-4 se observó en las células
epiteliales de los tumores de pacientes en los cuatro estadios, tanto en citoplasma como en
núcleo, además el nivel de expresión fue mayor en algunas células tumorales. (Figura 15). El
nivel de expresión de Gal-4 y localización no muestran tener una relación con el estadio
clínico, incluso muestras de diferentes estadios presentaron un nivel de expresión similar
entre ellas. Así mismo, la localización nuclear no parece estar asociada a la progresión del
cáncer, sin embargo, se requiere analizar un mayor número de muestras.

60
 Figura 15. Expresión de Gal-4 en tumores de pacientes con CCE de cérvix en diferentes estadios. La
expresión de la Gal-4 se muestra en células epiteliales de tumores de pacientes con diferentes estadios, tanto
en citoplasma como en núcleo, observando un nivel de expresión alto en algunas células tumorales. El
análisis estadístico no mostró una relación entre la intensidad de coloración con el estadio clínico.

61
 7.3.2. Expresión de galectina-4 en epitelio columnar.

La expresión de Gal-4 se evaluó en el epitelio columnar normal y adenocarcinoma, para ello

fueron procesadas 2 biopsias de epitelio columnar normal y 5 de adenocarcinomas.
Encontramos que el nivel de expresión de Gal-4 en células columnares de tejido normal fue
bajo, localizándose en el citoplasma, (Figura 16A y Figura 16B). En las muestras de
adenocarcinoma encontramos que el nivel de expresión de Gal-4 mostró un incremento,
detectando su presencia tanto en núcleo como en el citoplasma (Figura 16C y Figura 16D),
además observamos que las zonas de alta proliferación tienen una mayor expresión de la Gal-
4 (en la Figura 16D se señala con una flecha).

Figura 16. Inmunodetección de Gal-4 en epitelio columnar de muestras normales y con CaCu. Se muestra el
epitelio columnar normal (A y B) y con CaCu (C y D). Se encontró que epitelios columnares normales tienen
una baja expresión de Gal-4 a diferencia de los adenocarcinomas. En los tejidos de adenocarcinoma se
observó principalmente en las células columnares.

62
 7.3.3. Evaluación de la localización de galectina-4 en tejido cervical por
inmunofluorescencia

La localización de Gal-4 en epitelio escamoso con diagnóstico normal y con diagnóstico de

CaCu, fue determinada mediante ensayos de inmunofluorescencia, la expresión de Gal-4 se
muestra en color verde y los núcleos en color azul.

En el epitelio normal, se observa la membrana basal que delimita perfectamente el epitelio

escamoso del estroma, en el aumento 20X se puede observar con mayor detalle el orden que
mantienen las capas epiteliales (Figura 17). La localización de Gal-4 se detectó
principalmente en el citoplasma, sin embargo, también observamos la expresión de Gal-4 en
los núcleos (Figura 17C y F). Respecto al estroma, la expresión de Gal-4 se encuentra
predominantemente en el citoplasma y su presencia en algunos núcleos. En los vasos
sanguíneos se observa que Gal-4 tiene una fuerte señal en los glóbulos rojos.

Figura 17. Detección de Gal-4 por inmunofluorescencia en tejido de cérvix normal. La expresión de Gal-4 se
muestra en color verde (Alexa Fluor 488) y los núcleos en color azul (DAPI). Figura A y D, se muestra la
tinción de núcleos en aumento 10X y 20X. Figuras B y E se muestra la tinción de Gal-4 a un aumento de 10X
y 20X. En las figuras C y F se muestra el merge de ambas señales.

63
En el tejido con CaCu podemos ver que el epitelio perdió el orden en la estructura de las
láminas, no es posible observar a la lámina basal que naturalmente delimitaría con el estroma,
así como tampoco en las láminas superiores del epitelio escamoso (Figura 18). Se observa en
la Figura 18E que la proteína Gal-4 se localiza principalmente en los núcleos y con menor
presencia en el citoplasma, contrario a lo que se observó en epitelio normal. El cambio de
localización de Gal-4 también se observa en el estroma donde es predominantemente nuclear.

Figura 18. Localización de Gal-4 en el epitelio de un tejido con diagnóstico de CaCu. La expresión de Gal-4
se muestra en color verde y la tinción nuclear en color azul. Figuras A y D, se muestra la tinción de núcleos
en aumento 10X y 20X. Figuras B y E se muestra la tinción de Gal-4 a un aumento de 10X y 20X. En las
figuras C y F se muestra el merge de ambas señales.

En la biopsia de tejido con CaCu identificamos una zona que muestra características de una
lesión escamosa intraepitelial, con la lámina basal delimitada y con una pérdida moderada en
el orden en las láminas del epitelio (Figura 19). La localización de Gal-4 se encuentra en el
citoplasma, sin embargo, observamos núcleos con una alta tinción, a diferencia del epitelio

64
normal de la Figura 18. Estos resultados sugieren que el cambio de localización de la Gal-4
hacia el núcleo de las células empieza a observarse en lesiones precursoras. En el estroma se
observa una expresión de Gal-4 en la mayoría de los núcleos, pero no en el citoplasma.

Figura 19. Localización de Gal-4 en un epitelio con características de una lesión escamosa intraepitelial de
un tejido con diagnóstico de CaCu. La expresión de Gal-4 se muestra en color verde y los núcleos en color
azul. Figuras A y D, se muestra la tinción de núcleos en aumento 10X y 20X. Figuras B y E se muestra la
tinción de Gal-4 a un aumento de 10X y 20X. En las figuras C y F se muestra el merge de ambas señales.

65
 7.4.Concentración sérica de galectina-4 y la relación con su nivel de
expresión en tejido de pacientes con cáncer cervicouterino

Para evaluar si la concentración sérica de Gal-4 se relacionaba con el nivel de expresión en

las biopsias de tejido tumoral, se realizó un análisis de correlación entre el suero y la biopsia
correspondiente en un grupo de 10 pacientes (Tabla 11). Realizamos un análisis de
correlación de Spearman el cual no mostró significancia p=0.4918 (Figura 20).

Tabla 11. Nivel de expresión de Gal-4 en suero y tejido de pacientes con CaCu

Gal-4
Paciente Suero (pg/ml) Tejido (lum) Estadio FIGO
1 1462.14 59.86 IIB
2 563.63 91.95 IIB
3 647.86 102.89 IIIB
4 381.13 83.66 NC
5 507.86 120.24 IIIB
6 565.00 151.79 IIB
7 536.43 71.02 IIIB
8 414.88 104.87 IIB
9 913.63 64.59 IIB
10 493.63 61.98 IB

Figura 20. Gal-4 en suero y tejido de pacientes. En el nivel de expresión en tejido se muestra con la densidad
media de los niveles séricos, se muestran con la correlación de Spearman r, p=0.4918.

66
 7.5.Niveles de expresión del gen LGALS4 y proteína en líneas celulares de
cérvix

7.5.1. Cuantificación de la expresión del gen LGALS4 en líneas celulares.

Los niveles de expresión del gen LGALS4 se determinaron con un PCR tiempo real en líneas
celulares de cérvix, como control de fenotipo no tumoral se usaron las células HaCaT y el
control positivo de expresión fueron las células Jurkat.

Todas las líneas celulares evaluadas mostraron expresión del gen LGALS4, en la Figura 21
se muestran los niveles de expresión con respecto a la línea celular HaCaT. La línea celular
SiHa presentó la mayor expresión, siendo 3.31 veces mayor que la línea control (p<0.0001),
por otro lado, las líneas celulares CasKi, HeLa y C33A presentaron niveles de ARNm
semejantes a la línea control. La línea celular Jurkat que se utilizó como control positivo tuvo
una expresión 2.25 veces mayor que HaCaT (p<0.05).

4
****
Expresión relativa

3
*
2

HaCat Caski HeLa SiHa C33-A Jurkat

Figura 21. Niveles de expresión del gen LGALS4 en diferentes líneas celulares. La expresión fue analizada
mediante PCR tiempo real, los niveles de expresión del gen LGALS4 fueron normalizados con el gen
endógeno hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT), la expresión relativa fue obtenida empleando
el método ∆∆Ct. ANOVA de una vía con un post-análisis de Dunnet, * p<0.05, **** p<0.001

67
El nivel de expresión del gen LGASL4 no mostró cambios con respecto al origen celular ni
con respecto al tipo de VPH, ya que SiHa, Caski y C33A son de tipo escamoso y únicamente
SiHa mostró mayor expresión, además no tiene relación con el tipo de VPH, ya que HeLa
tiene integrado el genoma del VPH-18, mientras que SiHa y Caski tienen integrado el genoma
del VPH-16, por otro lado, C33A es negativa a VPH.

7.5.2. Evaluación de la expresión de la proteína galectina-4 en líneas celulares.

Para identificar la expresión de la proteína de Gal-4 usamos el ensayo de WB. Considerando

los resultados de expresión relativa en el que la línea celular SiHa mostró los niveles más
altos de ARNm del gen LGALS4 realizamos la detección de la proteína en esta línea celular,
así como en la línea celular HaCaT. Inicialmente usamos el anticuerpo monoclonal anti-Gal4
(ab175185), el cual tiene reactividad por Gal-4 de humano y reconoce Gal-4 de rata, el
reconocimiento se da en la región que comprende los aminoácidos 1-100. No se logró
detectar la proteína en las líneas celulares evaluadas, como control positivo usamos proteínas
de yeyuno del intestino delgado de rata (Figura 22).

Yeyuno SiHa HaCat

Gal-4
36 kDa

b-actina
42 kDa

Figura 22. Detección de Gal-4 en líneas celulares de cérvix. Se realizó Gal-4 mediante un western blot en
Inespecífico
líneas celulares SiHa y HaCat, como control positivo se usó yeyuno de rata. Como control de carga se usó un
anticuerpo anti--actina.

68
Para verificar si realmente la proteína Gal-4 estaba ausente en las células SiHa y HaCaT
realizamos los ensayos de WB empleando una clona diferente de anticuerpo anti-Gal4
(ab170638), este anticuerpo reconoce la región que comprende los aminoácidos 77-106. Para
este ensayo usamos como control positivo extracto proteico de células Jurkat, como lo señala
el inserto de la casa comercial. Los resultados muestran una banda de aproximadamente 36
kDa correspondiente al peso molecular de Gal-4 (Figura 23). Se realizó un análisis
densitométrico de la intensidad de las bandas, los resultados no muestran diferencias entre
las líneas celulares analizadas, como control usamos -actina que utilizamos para normalizar
los valores.

Figura 23. Identificación de la expresión de la Gal-4 en líneas celulares A. Nivel de expresión de Gal-4 en las
células HaCaT, SiHa y Jurkat. Se muestran los resultados del análisis densitométrico de las bandas de Gal-4
normalizadas con respecto a β-actina B. Ensayo de WB que muestra la detección de Gal-4 en líneas celulares
mencionadas, para el ensayo fueron usados 100 µg de proteína total para cada tipo celular. Se hizo un
análisis de ANOVA de una vía con un post análisis de Dunn´s, n=4.

69
 7.5.3. Localización de galectina-4 en líneas celulares

En las líneas celulares HaCat (no tumoral) y SiHa (CCE) se evaluó la localización de Gal-4
mediante una detección con inmunofluorescencia. En la Figura 24 se muestra en color verde
la localización de Gal-4 (B y E) y en color azul los núcleos de las células HaCaT y SiHa (A
y D). Observamos que en las células HaCaT, la proteína se localiza principalmente en el
citoplasma con baja presencia en los núcleos, mientras que en las células SiHa la proteína se
localiza principalmente en los núcleos con menor expresión en el citoplasma.

Figura 24. Localización de Gal-4 en líneas celulares. En el panel se ejemplifica la expresión de Gal-4 en
HaCat (control) y SiHa (CCE), en A y D se observa la tinción nuclear (DAPI), en B y E la expresión de Gal-4
y en C y F el merge de ambas señales. En las microfotografías se muestra la expresión de Gal-4 en color
verde y la tinción nuclar en color azul, las imágenes de tomaron con un objetivo de 63X de inmersión

70
 8. DISCUSIÓN
El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la concentración sérica de Gal-4 en
pacientes con CaCu y evaluar el nivel de expresión de Gal-4 en tejido y líneas celulares con
características normales y cáncer.

Los niveles séricos de Gal-4 en pacientes con CaCu fueron más altos que en el suero de
pacientes con diagnóstico normal. Los niveles séricos de galectina-4 se han analizado en
adenocarcinoma gástrico [156], cáncer de colon, cáncer de mama [146, 155] y carcinoma
hepatocelular (CHC) [141]. En todos los tipos de cáncer, se informó que la concentración
sérica de Gal-4 incrementa. En el caso del cáncer de colon, los niveles séricos de Gal-4
aumentaron 11,1 veces en general y 25,3 veces en pacientes con metástasis con respecto a
los niveles en el grupo sano; en pacientes con cáncer de mama, se detectó un aumento de 11
veces [146]. Con respecto al cáncer hepatocelular, la Gal-4 solo incrementó en el suero de
pacientes con CHC e infección por el virus de la hepatitis B [141], y también se encontró una
asociación entre niveles séricos más altos y características más agresivas del cáncer. Nuestros
resultados son similares a los reportados en otros tipos de cáncer, en los que los niveles
séricos de Gal-4 aumentan en pacientes con cáncer en comparación con pacientes sin
enfermedad. Además, observamos una tendencia hacia el aumento en la concentración sérica
de Gal-4 de pacientes con tumores queratinizantes en comparación con los tumores no
queratinizantes, así como en los estadios clínicos III y IV con respecto a los estadios clínicos
I y II. La queratinización es una característica morfológica identificable en CCE que
permitiría determinar el pronóstico de los pacientes. Los pacientes con tumores
queratinizantes presentaron una menor supervivencia respecto a los no queratinizantes,
además de que lo tumores queratinizantes tienen una pobre diferenciación y están en etapas
más avanzadas, lo que representa un peor pronóstico para las pacientes [164], esto también
ha sido reportado en carcinomas de células escamosas orofaríngeas[165]. Si bien no ha sido
evaluado el efecto que tiene un incremento de Gal-4 sérica en pacientes con tumores
queratinizantes ya he reportado que estos presentan un peor pronóstico.

71
En los carcinomas hepatocelulares y colorrectales, se ha informado de una asociación entre
concentraciones más altas de Gal-4 sérica y estadio clínico avanzado [141, 146]. Además, en
pacientes con hepatocarcinoma, las concentraciones séricas más altas de Gal-4 se asociaron
con metástasis [155]. Nuestros resultados sugieren que la Gal-4 podría tener un papel en la
invasión y metástasis de CC, pero se deben analizar más muestras de suero de pacientes en
estadio clínico IV para confirmar esta asociación. No se caracterizó el papel de la Gal-4
circulante. Los estudios in vitro sugieren que las galectinas circulantes podrían participar en
el reclutamiento de células tumorales en el endotelio vascular. Se demostró en un modelo in
vivo de ratones desnudos, que la galectina-3 circulante participa en la metástasis. La
galectina-3 se une al antígeno oncofetal de Thomsen-Friedenreich, que es un disacárido (Gal
β1,3GalNAc) presente en la proteína transmembrana MUC1 de las células tumorales, y la
interacción favorece la exposición de otras moléculas de adhesión, lo que facilita la adhesión
de las células tumorales al endotelio vascular [102].

Es importante mencionar que la desviación de los valores séricos de Gal-4 en pacientes con
CaCu fue alta; en algunos casos, los niveles séricos en pacientes con CaCu fueron similares
a los de mujeres sanas, y en otros casos, los niveles séricos en pacientes con CaCu fueron el
doble de los valores en mujeres sanas. En pacientes con adenocarcinoma gástrico, se han
informado valores de hasta 40 veces los valores en personas sanas en algunos pacientes con
cáncer, mientras que otros pacientes tienen valores similares a los de las personas sanas [156].
Estas diferencias podrían estar asociadas con la progresión del cáncer y podrían utilizarse
para la identificación temprana de pacientes con un mayor riesgo de progresión de la
enfermedad. Además se ha propuesto que las galectinas circulantes podrían ser dianas
terapéuticas para reducir la metástasis[156].

En otros tipos de cáncer y otras patologías Gal-4 sérica se ha propuesto como un biomarcador
de diagnóstico, de progresión o de seguimiento de la enfermedad. Hemos analizado la
utilidad clínica de Gal-4 sérica en el diagnóstico de CaCu, Gal-4 sérica podría funcionar
como un biomarcador diagnóstico. El AUC fue de 0.7515 con un punto de corte de 432.14
pg/ml que presenta una sensibilidad de 82.1% y una especificidad de 69.2%. En un contexto
clínico indicaría que una paciente con una concentración de Gal-4 sérica ≥ 432.14 pg/ml
puede ser diagnosticado con CaCu con una confianza del 82.1%. En pacientes con

72
adenocarcinomas gástricos Gal-4 sérica presentó un AUC de 0.904 y un punto de corte de
420 pg/ml con un valor de confianza de 62.5% [156]. La determinación plasmática de Gal-4
en cáncer colorrectal tuvo un AUC de 0.786, con un punto de corte de 525 pg/ml con una
sensibilidad del 90% y especificidad de 48.6% [166]. Las pruebas diagnósticas disponibles
actualmente para la prevención y detección de CaCu son el Pap y colposcopía, las pacientes
posteriormente son sometidas a un análisis mediante una biopsia dirigida. La prueba de Pap
presenta una sensibilidad de 57% y una especificidad del 76%, la colposcopia presenta una
sensibilidad de 92% y especificidad de 67% [167]. Gal-4 sérica presenta una mejor
sensibilidad y especificidad y podría ser usada como una prueba complementaria para la
detección de CaCu y en futuros estudios realizar un análisis combinado de Gal-4 sérica con
los estándares usados actualmente en el diagnóstico de CaCu.

También se ha informado que la expresión de galectina está alterada en los tejidos de

diferentes tipos de cáncer. La galectina-1 [168, 169], la galectina-3 [170, 171] y la galectina-
9 [118, 172, 173] son las más estudiadas[118, 172, 173]. Este es el primer informe de la
identificación de Gal-4 en tejido cervical, la expresión de Gal-4 se ha detectado en diferentes
tejidos y se informó por primera vez en el tracto digestivo y el hígado [120]. Durante la
transformación celular, la expresión de la Gal-4 cambia y, en algunos tipos de cáncer, su
expresión se ha relacionado con el estadio o el pronóstico [141]. En tejido de pacientes con
CaCu ya había sido detectada la presencia de ARNm del gen LGALS4 con un análisis de
microarreglos, se encontró una disminución respecto a muestras normales [154],[132, 174],
pero hasta hoy no se había analizado la proteína Gal-4.

La tinción inmunohistoquímica mostró que la Gal-4 se expresaba preferentemente en el

citoplasma de células epiteliales normales, y su expresión en células SCC se observó en el
citoplasma y núcleos, mostrando cambios en la localización asociados con la transformación
del cáncer. Con respecto a las células columnares normales, se detectó la débil expresión de
Gal-4 en el citoplasma. En el adenocarcinoma, la expresión fue mayor que en el epitelio
columnar normal y también se observó principalmente en los núcleos. Para algunas
galectinas, se han informado cambios en la localización intracelular asociados con el cáncer;
La galectina-7 se detectó en núcleos de tejido epitelial esofágico normal, y en el carcinoma
de células esofágicas, su expresión se detectó en el citoplasma, núcleos y membrana [175].

73
La localización nuclear preferencial de galectina-3, sobre la localización citoplásmica, se
propuso como un indicador pronóstico de recurrencia en pacientes con carcinoma de pulmón
[176]. La galectina-1 induce la migración de las células tumorales epiteliales mamarias, y
esta influencia se ejerce cuando la proteína se localiza en el núcleo. También se informó que
el cambio en la localización es el resultado de la glicosilación, lo que demuestra que la
sialilación α-2,6 interfiere con la interacción de galectina-1 con glicanos LacNAc, lo que
permite la translocación de galectina-1 al núcleo [168]. Durante la transformación del cuello
uterino, se ha informado un aumento de la expresión de ácido siálico según el grado de
transformación [177, 178]. El aumento de ácido siálico en el tejido CaCu puede participar en
la translocación de Gal-4 al núcleo.

El análisis de expresión de Gal-4 mostró una diferencia significativa entre tumores

queratinizantes y no queratinizantes, y los tumores queratinizantes presentaron mayor
tinción. La Cancer Genome Atlas Research Network informó una caracterización molecular
de los tumores CaCu. Los resultados mostraron tres grupos de CaCu: el grupo con alto
contenido de queratina, que presenta una alta expresión de genes relacionados con la familia
de las queratinas; el grupo bajo en queratina, que presenta baja expresión de genes de la
familia de la queratina; y el grupo rico en adenocarcinoma. Estas clasificaciones muestran
que es posible identificar diferentes subtipos de CaCu según los patrones de expresión génica
[20]. En nuestros resultados, detectamos una mayor expresión de Gal-4 en tumores
queratinizantes en comparación con tumores no queratinizantes, lo que sugiere que el gen
LGALS4 podría ser parte del grupo de genes con alta expresión y desempeñar un papel en
este subtipo molecular. Para confirmar esta posibilidad, son necesarios más estudios. Se ha
informado que los pacientes con el tipo de SCC queratinizante tienen estadios avanzados (III-
IV) de la enfermedad; Además, el CaCu en estadio IV también se asoció con una peor tasa
de supervivencia, peor pronóstico y menor respuesta a tratamiento, lo que sugiere que el
estado de queratinización es un predictor independiente de supervivencia [164].

Estos resultados resaltan la importancia de considerar los subtipos moleculares en el

pronóstico del CaCu, con la finalidad de diseñar terapias dirigidas. Aún se desconoce el papel
de la Gal-4 en el tejido de CaCu, y debe investigarse la función de la Gal-4 nuclear en la
progresión del cáncer.

74
Los estudios realizados en líneas celulares (in vitro) o en animales (in vivo) permiten analizar
funciones en las que Gal-4 se podría encontrar involucrada, ya que estas funciones o
características no pueden determinarse directamente en los pacientes. Por lo que fue de
nuestro interés caracterizar la expresión de Gal4 en líneas celulares. Cabe mencionar que este
es el primer trabajo en el que se evalúa la expresión de Gal-4 en líneas celulares cervicales.

La expresión del gen LGALS4 fue analizada en un pool de líneas celulares cervicales que
presentaron una menor expresión cuando se comparó con tejido cervical normal [132]. En el
presente trabajo de las líneas celulares analizadas encontramos una mayor expresión de
ARNm en SiHa respecto a las líneas HaCat y Jurkat, que fueron usadas como controles. La
expresión no se puede asociar con el tipo celular ya que SiHa, Caski y C33-A son derivadas
de un CCE y HeLa es de un adenocarcinoma. En otro estudio en el que se evaluaron dos
líneas celulares que se originaron del mismo tumor de páncreas, se encontró una diferencia
marcada en la expresión de ARNm y proteína, mientras que PaTu-S presentó niveles mayores
de hasta de 10 veces, PaTu-T no mostró expresión, esta última mostró una mayor capacidad
metastásica [142].

Posteriormente se analizó la presencia de la proteína Gal-4 en SiHa, HaCat y Jurkat, se

detectó la proteína de 36 kDa en las tres líneas celulares evaluadas, no encontramos
diferencias respecto a los controles, lo cual fue sorprendente ya que esperábamos un
incremento similar de la proteína como fue analizado en el ARNm. En otros tipos celulares
como páncreas [142], y de colon [144] se ha analizado tanto el mensajero como la proteína,
y aunque se detectaron los niveles de ARNm, estos no coincidieron con el nivel de proteína
detectado. Esto puede deberse a que el anticuerpo utilizado no reconoce de manera eficiente
a la proteína. En nuestro trabajo usamos dos clonas diferentes de anticuerpos anti-Gal-4 ya
que la primera (ab175185) no tuvo reconocimiento en las líneas celulares humanas, pero sí
en proteína de yeyuno de rata, en caso contrario al segundo anticuerpo utilizado (ab170638),
reconoció satisfactoriamente Gal-4 en las líneas celulares.

También logramos identificar a la proteína Gal-4 mediante inmunofluorescencia en

citoquímicas de SiHa y HaCat, la expresión de Gal-4 fue diferencial, en la línea control se
observa principalmente en el citoplasma, mientras que en SiHa la encontramos

75
principalmente en los núcleos. La localización subcelular podría determinar el tipo de
proceso celular en el que está participando Gal-4, la que se encuentra en citoplasma
disminuye los niveles de -catenina, en consecuencia, -catenina no se transloca al núcleo y
no activa genes claves de la vía WNT, que se asocia a procesos de diferenciación y migración
celular [179].

76
 9. CONCLUSIONES
Los niveles séricos de Gal-4 en los pacientes con CaCu fueron más altos que en los pacientes
sin enfermedad y la tendencia de mayor concentración en los pacientes con estadio clínico
avanzado sugieren que la Gal-4, al igual que otras galectinas, podría participar en la
migración y la metástasis.

Mediante un análisis de curva ROC logramos visualizar que la Gal-4 sérica es un prometedor
biomarcador para diagnóstico de CaCu, ya que presentó una sensibilidad del 82.1% con un
punto de corte ≥ 432.14 pg/ml para diferenciar a los pacientes con CaCu.

La Gal-4 se expresa en el epitelio escamoso normal y columnar cervical y en las células

estromales. En el tejido normal, se detectó la expresión de Gal-4 en el citoplasma; en las
muestras de tumores de CCE y adenocarcinoma, la expresión se observó en núcleos, lo que
sugiere que el cambio de localización podría estar relacionado con la transformación celular.
El aumento de la expresión de Gal-4 en los tumores queratinizantes en comparación con los
tumores no queratinizantes sugiere que este gen podría ser parte del grupo de genes
relacionados con este subtipo CC y podría estar relacionado con un peor pronóstico.

En líneas celulares se detectó la presencia de ARNm del gen LGALS4, SiHa tuvo la mayor
expresión respecto al control, por primera vez se detectó la proteína Gal-4 en líneas celulares
cervicales, pero no fue proporcional a los niveles de ARNm encontrados. Adicionalmente,
se determinó la localización subcelular de Gal-4 en células SiHa, observándose
principalmente en núcleo, lo que sugiere que podría existir una función asociada a la
localización.

77
 10. PERSPECTIVAS
Gal-4 es una proteína poco estudiada y en CaCu este es el primer reporte de su expresión. Se
propone que el trabajo en un futuro se continúe con análisis que ayuden a esclarecer tanto su
participación en el desarrollo de CaCu, con la finalidad de evaluar su potencial uso como un
biomarcador o un posible blanco terapéutico. Para lo que se propone Gal-4 sérica sea
analizada en un grupo más amplio de pacientes con CaCu para confirmar la asociación con
las características clínico-patológicas como el estadio clínico, el tamaño tumoral, la
queratinización, invasión entre otros. Así como analizar los niveles de Gal-4 sérica en las
pacientes durante y después del tratamiento en forma grupal y en cada estadio clínico.
Determinar el poder discriminatorio de Gal-4 en los estadios clínicos avanzados (III y IV) y
analizar sí es un posible marcador de progresión, recurrencia y supervivencia. Analizar
también si el incremento de la concentración de Gal-4 sérica tiene una correlación con
procesos inflamatorios que se han asociado al desarrollo y progresión de CaCu.

A nivel celular se propone caracterizar los procesos biológicos en los que interviene Gal-4
para determinar su participación en el desarrollo del CaCu a través de estudios in vitro donde
se pueda analizar la adhesión, la tasa de proliferación, la capacidad de invasión, tanto para
Gal-4 intracelular y extracelular. Además, determinar el origen de Gal-4 sérica mediante
experimentos en la sección leucocitaria de muestras sanguíneas de pacientes con CaCu.

78
 11. REFERENCIAS
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10.18632/oncotarget.2104. PubMed PMID: 24977327; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4170638.

92
 ANEXO I: Preparación de soluciones y material

Preparación de laminillas para histoquímica

Las laminillas (2951-001T, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) se agruparon en un rack y
fueron se sumergidas por 1 min en solución APES al 2% en constante movimiento, luego se colocaron
en metanol 100% por 1 min en agitación, 2 lavados de 1 min en agua bidestilada. Finalmente, las
laminillas se secaron a 37°C por 24 hrs.

Buffer de citratos 10 mM, pH 6

Citrato de sodio 2.94 gr
Agua bidestilada hasta 1 Litro

PBS pH 7.2-7.4
1X Concentración final
Cloruro de sodio (NaCl) 8.00 gr 130 mM
Cloruro de potasio (KCl) 0.20 gr 3.0 mM
Fosfato de sodio (Na2HPO4) 1.44 gr 8.1 mM
Fosfato de potasio (KH2PO4) 0.24 gr 1.5 mM
Agua bidestilada hasta 1 Litro

BSA 1%
Albúmina sérica bovina 1.0 gr
Agua bidestilada hasta 100 mL

BSA 5%
Albúmina sérica bovina 5.0 gr
Agua bidestilada hasta 100 mL

Triton X-100 2%
Triton x-100 200 µL
Agua bidestilada hasta 10 mL

93
Poliacrilamida 30%
Acrilamida 7.3 gr
Bis-acrilamida 0.2 gr

Persulfato de amonio 10%

Persulfato de amonio 1.0 gr
Agua bidestilada hasta 10 mL

Dodecilsulfato de sodio (SDS) 10%

SDS 1.0 gr
Agua bidestilada hasta 10 mL

Tris base 0.5 M pH 6.8

Tris base 6.05 gr
Agua bidestilada hasta 100 mL

Tris base 1.5 M pH 8.0

Tris base 18.15 gr
Agua bidestilada hasta 100 mL

Buffer Laemmli
1X 10X Concentración final
Tris base 3.0 gr 30.0 gr 25 mM
Glicina 14.0 gr 140.0 gr 192 mM
SDS 1.0 gr 10.0 gr 0.1 %
Agua bidestilada hasta 1 litro 1 litro

Buffer de transferencia 0.06% pH 8.3-8.5

Tris base 3.03 gr
Glicina 14.4 gr
SDS 0.6 gr

94
Metanol 200 mL
Agua bidestilada hasta 1 litro
NOTA: No ajustar el pH, únicamente medirlo

Solución de lavado TBS y TBS-T

10X
Tris base 24 gr
NaCl 88 gr
Agua bidestilada hasta 1 litro
NOTA: ajustar pH a 7.5 con HCl, refrigerar a 4°C.Para prepata 1 litro de TBS-T 1X añadir 0.5 ml de
Tween 20

Buffer de carga para proteínas

2X
Glicerol 2.00 ml
SDS 10% 2.00 ml
Tris base 0.5 M pH 6.8 1.25 mL
-mercaptoetanol 0.50 mL
Azul de bromofenol pizca
Agregar agua bidestilada hasta 10 mL

Buffer Stripping
Tris HCl 6.25 mL (1 M pH 6.8)
SDS 10 mL
-mercaptoetanol 100 µL
Agregar agua bidestilada hasta 100 mL

RIPA
1X Concentración final
Tris HCl, pH 7.4 150 µL 50 mM
NP-40 200 µL 1%
Deoxicolato de sodio 0.5%
SDS 0.1%

95
Cloruro de sodio 150 mM,
EDTA 2 mM
Agregar agua bidestilada hasta 20 mL

Preparación de gel de poliacrilamida

Concentrador al 4%
Poliacrilamida 30% 330 µL
Tris base 0.5 M pH 6.8 630 µL
SDS 10% 33 µL
Agua bidestilada 1500 µL
Persulfato de amonio 10% 10 µL
TEMED 4 µL

Separador al 12%
Poliacrilamida 30% 2000 µL
Tris base 1.5 M pH 8.0 1300 µL
SDS 10% 50 µL
Agua bidestilada 1600 µL
Persulfato de amonio 10% 50 µL
TEMED 10 µL

96
 ANEXO II: Consentimiento informado

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL

Coordinación de Investigación en Salud

Comisión Nacional de Investigación Científica

CONSENTIMIENTO INFORMADO
PARA PARTICIPAR EN EL PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN:
Expresión de Galectina 9 en cáncer cervicouterino: marcador predictivo de
respuesta al tratamiento y supervivencia

Patrocinador externo: NO APLICA

Lugar y Fecha:_______________________________________________
No. de registro: R-2017-785-119

Justificación y objeto del estudio

Estimada Paciente, se le invita a participar en el estudio de investigación, Expresión de
Galectina 9 en cáncer cervicouterino: marcador predictivo de respuesta al
tratamiento y supervivencia, registrado ante la Comisión Nacional de Investigación
Científica del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Dicho proyecto se llevará a cabo
en Unidad Médica de Alta Especialidad, CMN Manuel Ávila Camacho del IMSS, y en el
Centro de Investigación Biomédica de Oriente, ubicado en la ciudad de Metepec, Puebla.
El objetivo de la investigación es: Evaluar la expresión de galectina-9 en cáncer
cervicouterino como un marcador predictivo de respuesta al tratamiento y supervivencia.
La galectina-9 es una proteína que participa en muchas funciones de la célula, como
controlar la velocidad a la que se divide, o la capacidad que tiene de invadir otros tejidos.
Cuando una célula normal se transforma en una célula tumoral o cancerosa se presentan
muchas alteraciones, una de ellas es la disminución en la cantidad de esta proteína, estos
cambios le permiten a la célula cancerosa dividirse sin control lo que favorece el crecimiento
del tumor.
Este proyecto en particular está dedicado al estudio de una región del cuerpo de las mujeres
llamada cérvix o cuello del útero (matriz), que es el sitio en el que se unen la matriz y la
vagina. En este sitio se desarrolla un tipo de cáncer llamado cervicouterino (cáncer del
cuello del útero).
Tal vez usted ya sabe que el cáncer cervicouterino es una enfermedad grave que afecta a
muchas mujeres mexicanas, por lo que el presente proyecto busca determinar si analizar
la cantidad de galectina 9 puede ayudar a determinar el pronóstico del tumor, o dar
seguimiento a las pacientes para identificar si existe una recaída, lo cual podría ser utilizado
para identificar la presencia de cáncer lo más pronto posible. La cantidad de esta proteína
en el tejido del cuello del útero puede modificarse en relación a la presencia y el tipo de
virus del papiloma humano.
Usted ha sido elegida para participar en este proyecto de investigación porque al realizarle
estudios de patología el reporte indicó que usted tiene cáncer cerivouterino.
Al igual que usted, serán invitadas a participar otras pacientes que, de forma voluntaria y
sin ninguna presión, acepten participar en el estudio. Por favor lea la información que le
estamos proporcionando y si tiene alguna pregunta, con gusto le aclararemos sus dudas.

97
Su participación es voluntaria y su decisión de participar o no en este proyecto no afecta en
nada su relación con el IMSS, es decir que Usted seguirá recibiendo la atención médica
requerida para mejorar su salud independientemente de que decida o no participar en este
estudio.
Procedimientos
Como parte de la atención que normalmente le brinda el IMSS, Usted se le realizan algunas
preguntas sobre su estado de salud y sus antecedentes clínicos, se le realizará una
exploración física minuciosa y los estudios de laboratorio que su médico juzgue
convenientes, así como los procedimientos clínicos o quirúrgicos necesarios para tratar su
enfermedad, en caso de tenerla. En este sentido el participar en el estudio no hará ningún
cambio respecto a la atención que le brinda su médico en esta unidad, si es que fuera
necesario.

Dependiendo de la etapa en que se encuentre su enfermedad (cáncer), se le realizarán

diferentes tipos de tratamiento, los cuales incluyen cirugía, radioterapia y/o quimioterapia,
su médico oncólogo, determinará cuál es el tratamiento más adecuado para tratar su
enfermedad, para esto tomará en cuenta su edad, el número de hijos que haya tenido, su
condición en general y el grado de avance de su enfermedad.
En ciertos casos de cáncer el médico decide retirar la parte del cuello de la matriz que está
lesionada, mediante un tratamiento quirúrgico que se llama conización o simplemente cono
(ya que la parte removida tiene dicha forma). En otros casos el médico puede decidir por
retirarle quirúrgicamente toda la matriz (o útero), los ovarios y ganglios, si estuvieran
comprometidos. Recuerde que esto dependerá de la gravedad de su enfermedad y las
decisiones que tome el médico oncólogo que la está tratando, y en ningún caso se hace
con el fin de aportar muestras a este proyecto de investigación.

Como parte de este estudio se le pedirá responder a un cuestionario que le aplicará una
enfermera o un auxiliar del proyecto. El tiempo requerido para completar el cuestionario
será de máximo 15 minutos.

Se le tomará una muestra del cuello del útero, siguiendo el mismo procedimiento utilizado
para el estudio de Papanicolaou (raspado cervical); esta muestra se utilizará para conocer
mediante procedimientos de laboratorio el tipo de virus de papiloma humano presente en
las células.

Se le tomará una muestra de 3 ml sangre, que equivalente a media cucharadita cafetera,

para evaluar la concentración de galectina-9 y determinar si está asociada con la presencia
de la enfermedad.

Se le solicita su autorización para poder utilizar parte del tejido que le haya sido retirado, ya
sea como cono, biopsia o útero completo, para realizar otras pruebas de laboratorio que
nos ayuden a identificar la cantidad de galectina 9. También le pedimos su autorización
para conservar y almacenar las partes de las muestras de tejido no utilizadas en este
estudio, para ser utilizadas en otros proyectos de investigación futuros que ayuden a
detectar, prevenir y tratar el cáncer cervicouterino.

98
momento, termina su participación en el estudio.
Por ningún motivo se solicitará que usted asista al Hospital para la toma de muestra, esta
se hará durante las citas de revisión que usted tenga programadas. Al respecto cuando se
haga la toma de muestras de sangre de seguimiento, se tomarán algunos datos clínicos
con respecto a la evolución de la enfermedad, tipo de tratamientos aplicados, resultados de
laboratorio, estos datos serán tomados de su expediente concluyendo la consulta, lo que
tomará máximo 5 min.
Los investigadores analizaremos los resultados y los publicaremos en Foros y revistas
especializadas, sin que sea posible identificar a ninguna participante.
Posibles riesgos y molestias.
La toma de las muestras de laboratorio no implica riesgo para usted porque será realizada
por personal médico capacitado.
El raspado cervical se realiza con un cepillo desechable (solo se usa una vez) que raspa
suavemente la superficie del cuello de la matriz. Las molestias que usted podría presentar
son las mismas que usted ha sentido cuando le toman muestras para el Papanicolaou. En
algunas ocasiones se puede presentar ligero dolor, pero éste desaparece en poco tiempo
sin necesidad de recibir medicamentos.
La toma de sangre le ocasionará molestias mínimas, como el leve dolor por el piquete con
la aguja en el antebrazo al tomar la muestra de sangre, existiendo la posibilidad de formarse
un moretón en el lugar de la toma de muestra de sangre .
Las muestras de tejido serán tomadas de las de la biopsia que le fue tomada para realizar
el diagnóstico de su enfermedad.
Posibles beneficios que recibirá al participar en el estudio.
Por su participación en el estudio usted no tendrá que hacer ningún gasto y tampoco recibirá
ningún pago. La atención médica, medicamentos, exámenes, tratamientos y cirugías, etc.
que requiera para su enfermedad será proporcionados por el Instituto Mexicano del Seguro
Social (IMSS), gracias a que usted es derechohabiente.
Su participación en el estudio no tendrá ningún beneficio inmediato para usted, sin
embargo, será importante ya que ayudará a que esta enfermedad se conozca mejor y
podamos proponer mejores métodos de diagnóstico; esto beneficiará en el futuro a otras
personas que sufran de la misma enfermedad.
Información sobre resultados y alternativas de tratamiento,
Ya que los resultados de este estudio no cambiarían el pronóstico, la evolución, ni el
tratamiento de su enfermedad, no se considera necesario entregarle ningún reporte del
mismo. Pero si usted está interesada en conocer los resultados del proyecto, tiene el
derecho de solicitarlos al investigador responsable.
Participación o retiro. Su participación en este estudio es completamente voluntaria; si
usted decide no participar en el estudio, seguirá recibiendo la atención brindada por el
IMSS y se le ofrecerán los procedimientos y tratamientos habituales. De la misma forma,
usted

99
podrá abandonar el estudio en el momento que así lo decida, sin que eso afecte el
seguimiento o la atención que se le proporciona en el IMSS.
Privacidad y confidencialidad. La información será guardada de manera confidencial y
por separado para garantizar su privacidad. Cuando se conjunten los datos de todos los
participantes en el estudio y se realice el análisis, su nombre permanecerá oculto, al igual
que al presentar los resultados en una publicación o conferencia.
Solo cuando el médico tratante lo solicite se le proporcionarán los resultados obtenidos de
este estudio, o bien cuando por alguna situación especial lo requiera la ley.

En caso de colección de material biológico:

No autorizo que se tome la muestra.
Si autorizo que se tome la muestra solo para este estudio.
Si autorizo que se tome la muestra para este estudio y estudios futuros. Las muestras
serán almacenadas por un periodo de 10 años.

Beneficios al término del estudio:

Al término del estudio, los resultados generados permitirán evaluar si la determinación de
galectina-9 puede ser utilizada como un marcador para dar seguimiento a las pacientes con
CaCu y determinar de manera más temprana su exista una recaida o persistencia de la
enfermedad.
Si tiene usted preguntas o desea hablar con alguien del equipo médico, puede comunicarse
con el Responsable Médico del Proyecto en su Unidad:
Dr.________________________ Teléfono:___________ correo: _____________
En caso de dudas o aclaraciones relacionadas con el estudio podrá dirigirse con su médico
o con la investigadora responsable del estudio la Dra. Verónica Vallejo Ruiz al teléfono (244)
444 01 22 de lunes a viernes de las 8:00 a las 16:00 horas o cualquier día de la semana al
celular 22 21 60 21 54, con sede en la Ciudad de Puebla México. En caso de requerir mayor
y más detallada información, puede escribir al correo veronica.vallejor@imss.gob.mx
En caso de dudas o aclaraciones sobre sus derechos como participante podrá dirigirse a la
Comisión de Ética de la Comisión Nacional de Investigación Científica del IMSS: Avenida
Cuauhtémoc 330 4° piso Bloque “B” de la Unidad de Congresos, Col. Doctores. México,
D.F., CP 06720. Teléfono (55) 56276900 extensión 21230, Correo electrónico:
comiteeticainv.imss@gmail.com

DECLARACION DE CONSENTIMIENTO INFORMADO.

Se me ha explicado con claridad en qué consiste el estudio, además he leído el contenido

de este formato de consentimiento; se me ha dado la oportunidad de hacer preguntas y

100
todas mis dudas han sido aclaradas; consta en esta carta con mi firma mi participación
voluntaria.

________________________________________
Nombre y firma del participante

Firma del encargado de obtener el consentimiento informado

Le he explicado el estudio de investigación ala participante y he contestado todas sus
preguntas. Creo que ella entiende la información descrita en este documento y libremente
da su consentimiento a participar en este estudio de investigación.

__________________________________________________
Nombre del encargado de obtener el consentimiento informado

_______________________________________________________________
Firma del encargado de obtener el Consentimiento Informado Fecha

_______________________________________________________________
Testigo 1
Nombre, dirección, relación con el paciente y firma

_________________________________________________________
Testigo 2
Nombre, dirección, relación con el paciente y firma

101
 ANEXO III: Publicación y congresos
Se realizó la publicación del trabajo de tesis

• Evaluation of Serum Levels and Expression of Galectin-4 in Cervical Cancer

Ileana Conde-Rodríguez, Guadalupe Delgado-López, Erick Armenta-Castro, Ivonne Ramírez-Díaz,

Maricruz Anaya-Ruiz, Claudia T. Gutiérrez-Quiroz, Juan Carlos Flores-Alonso, Salvador Reyes-
Salinas, Víctor J. Vazquez-Zamora, Francisco J. Ceja-Utrera, Aurelio López-Colombo, Julio Reyes-
Leyva

BioMed Research International (https://www.hindawi.com/journals/bmri/2020/6756723/)

El trabajo fue presentado en congresos

• Evaluación de la concentración de galectina-4 en pacientes con lesiones premalignas y cáncer

cervicouterino
XXIV Foro Sur de Investigación en Salud, presentación en poster (Junio 2017)
• Evaluation of galectin-4 concentration in serum of patients with premalignant injuries and
cervical cancer
4th Latin American Congress of Glycobiology, presentación en poster (Octubre 2017)

• Evaluation of galectin-4 in serum and tissue of patients with premalignant lesions and cervical
cancer
4ta Reunión Anual de Colegio Mexicano para la Investigación del Cáncer, (Octubre 2017)
• Evaluación de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes con lesiones premalignas
y cáncer cérvicouterino
XXVI Foro Nacional de Investigación en Salud, presentación en poster (Octubre 2017)
• Evaluación de la concentración de galectina-4 sérica en pacientes con lesiones premalignas y
cáncer cervicouterino
XXV Foro Sur de Investigación en Salud, presentación en poster (Julio 2018)
• Evaluación de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes con cáncer cervicouterino
XXVII Foro Nacional de Investigación en Salud, (Septiembre 2018)
• Evaluación de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes con lesiones premalignas
y cáncer cervicouterino

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 XXVII Jornadas de Educación e Investigación para Médicos Residentes “Dr. Juan Augusto
Rafael Larrauri Rodríguez” (Enero 2019)
• Evaluación de la concentración de galectina-4 en suero de pacientes con lesiones premalignas
y cáncer cervicouterino
XXVI Foro Sur de Investigación en Salud (Octubre 2019)
• Evaluación de galectina-4 en suero y tejido de pacientes con lesiones premalignas y
cáncercervicouterino
5º Latin American Congress of Glycobiology, presentación en poster (Octubre 2019)

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