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FENOLES TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LA PULPA DE CACAO:

ESTUDIO DE PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO

Por
VIDYA ENDRAIYANI

Una tesis presentada a la

Escuela de Graduados-Nuevo Brunswick

Rutgers, Universidad Estatal de Nueva Jersey

en cumplimiento parcial de los requisitos

por el grado de

Maestro de la ciencia

Programa de Posgrado en Ciencias de los Alimentos

escrito bajo la dirección de

Profesor MV Karwe

y aprobado por

_____________________________

_____________________________

_____________________________

Nuevo Brunswick, Nueva Jersey

mayo de 2011
 RESUMEN DE LA TESIS

FENOLES TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LA PULPA DE CACAO:

ESTUDIO DE PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO

por VIDYA ENDRAIYANI

Directora de Tesis:

Dr. Mukund V. Karwe

La pulpa de cacao, el mucílago blanco que envuelve los granos de cacao, es el sustrato principal

en la fermentación del grano de cacao y es rico en macro y micronutrientes. Aun así, la presencia de

los fenoles y su actividad antioxidante en la pulpa de cacao no han sido explorados. El

objetivos de este estudio fueron cuantificar los fenoles totales de la pulpa de cacao utilizando Folin-

Ensayo de Ciocalteu y actividad antioxidante mediante el uso de la Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno

(ORAC), así como el ensayo de actividad antioxidante celular (CAA). El efecto de la soltería

y se investigó la doble pasteurización para comprender mejor el valor potencial para la salud

y posteriormente promover el aprovechamiento de la pulpa de cacao. Estudios de almacenamiento de ocho semanas en

También se realizaron 4ºC, 25ºC y 37ºC para monitorear la estabilidad de los fenólicos, ORAC

valores y color de la pulpa de cacao pasteurizada.

La pasteurización simple y doble disminuyó el contenido de fenoles de la pulpa de cacao en

25% y 38%, respectivamente, en comparación con la pulpa no pasteurizada (103,76±4,79 mg

yo
GAE/100 g pulpa). Los valores de ORAC no fueron significativamente diferentes entre

sin pasteurizar (1871±58 µmol TE/100 g de pulpa), simple (1835±41 µmol TE/100 g de pulpa),

y pulpa doblemente pasteurizada (1681±157 µmol TE/100 g de pulpa). Hubo un significativo

incremento en los valores CAA (EC50) de pulpa doble pasteurizada (59.76±9.26 µmol QE/100

g de pulpa) en comparación con la pulpa sin pasteurizar (23,71±3,12 µmol QE/100 g de pulpa). Por lo tanto, hay

hubo una débil correlación negativa entre los valores ORAC y CAA al cuantificar el

actividad antioxidante de la pulpa de cacao. Diferencias de color generales (ΔE*) en relación con

pulpa no pasteurizada no fueron significativamente diferentes entre solo (11,50 ± 6,64) y

pulpa doble pasteurizada (14,96±8,64).

A lo largo de los estudios de almacenamiento de ocho semanas, la pulpa pasteurizada simple y doble

mostró muy poco cambio en el contenido de fenoles y los valores ORAC a 4ºC y 25ºC.

Sin embargo, a 37 ̊ C, hasta un 50 % de pérdida relativa en el contenido de fenoles y un 40 % de pérdida relativa en

los valores de ORAC se observaron en pulpa única pasteurizada; mientras que el doble

la pasteurización dio como resultado una pérdida relativa menor. Pulpa pasteurizada simple y doble

mostró los valores más bajos de luminosidad (L*) cuando se almacenó a 37ºC, así como la tonalidad más baja

valores de ángulo y croma cuando se almacena a 4ºC, lo que sugiere menos cambios de color a menor

temperatura de almacenamiento.

iii
 AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero expresar mi agradecimiento a mi asesor, el Dr.

Mukund V. Karwe, por su inmenso apoyo durante mis estudios en la Universidad de Rutgers.

Su paciencia, orientación y pasión por la enseñanza fueron recursos invaluables tanto para mi

desarrollo personal y profesional. he tenido la suerte de poder trabajar

bajo su destacada dirección.

Quisiera agradecer especialmente al Dr. Richard D. Ludescher por ser un

mentor accesible. Sus aportes constructivos y debates que invitan a la reflexión.

ciertamente contribuyó al éxito de mi estudio en Rutgers.

También me gustaría agradecer al Dr. Rong Di del Departamento de Biología Vegetal y

Patología por compartir amablemente sus conocimientos y equipos en el ensayo biológico

utilizado en este estudio de investigación.

Un agradecimiento especial al Dr. Kasi Sundaresan y al Dr. Don Giampetro en nombre de iTi

Tropicals (Lawrenceville, NJ) por el apoyo financiero y los conocimientos que hicieron de este

investigación posible.

Un sincero agradecimiento a Dave Petrenka, Frank Caira y Rieks Bruins por su ayuda en

diseñando los equipos de pasteurización y asistiendo en la ejecución de la térmica

procesamiento de parte de este estudio. Además, también me gustaría agradecer a Hailong Yu y

Pam Ting por su ayuda sincera y gentil para ayudarme a solucionar los problemas del celular.

ensayo antioxidante en mis experimentos.

IV
 Para mis compañeros de laboratorio, Jose, Swetha, Li, Meenakshi, Anand, Nidhi, Siddhi y Rajay,

Estoy agradecido por compartir el conocimiento, el apoyo, el humor y la diversidad en nuestro laboratorio. Todos ustedes

he llenado mis días en Rutgers con genuina amistad y risas.

Deseo agradecer a mi mejor amigo, David, por el apoyo emocional y la confianza

que sinceramente ha extendido.

Por último, pero no menos importante, me gustaría agradecer a mis padres y a mi hermana, Yulia, por

han sido de gran bendicion en mi vida. Sin su amor, no seré quien y donde sea

Estoy de pie hoy. A ellos les dedico esta tesis.

v
 TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN DE LA TESIS ............................................... ............................................ ii

AGRADECIMIENTOS................................................. .......................................... iv

TABLA DE CONTENIDO............................................... .................................................... ..vi

LISTA DE FIGURAS ............................................... .................................................... ..........ix

LISTA DE TABLAS............................................... .................................................... ...........xii

I. REVISIÓN DE LA LITERATURA ............................................... ..........................................1

I.1. Pulpa de cacao .................................................. .................................................... .............1

I.1.a. Composición de la pulpa de cacao .............................................. ...............................2

I.1.b. El papel de la pulpa de cacao en la fermentación del grano de cacao...........................5

I.1.c. Uso potencial de la pulpa de cacao .............................................. ..........................8

I.2. Ensayo de medición de antioxidantes ............................................... .............................11

I.2.a. Ensayo químico de antioxidantes .............................................. ..........................11

I.2.b. Ensayo de antioxidantes celulares (CAA) ............................................... .....................13

I.3. Actividad antioxidante afectada por el procesamiento térmico ....................................... 16

I.3.a. Procesado térmico de productos a base de frutas ........................................... ......17

I.3.b. Efecto del procesamiento térmico sobre la calidad sensorial y nutricional de los frutos.

productos a base .................................................. .............................................20

II. OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN ............................................... .......................23

II.1. Objetivos .................................................. .................................................... ..........23

II.2. Justificación .................................................. .................................................... .............23

vi
tercero MATERIALES Y MÉTODOS............................................... ..........................24

III.1. Planteamiento esquemático del estudio .............................................. .............................24

III.2. Lista de productos químicos utilizados ............................................. ..........................................25

III.3. Muestras de pulpa de cacao .............................................. ..........................................26

III.4. Procesamiento térmico de pulpa de cacao .............................................. ..........................27

III.5. Estudio de almacenamiento................................................. .................................................... ........29

III.6. Extracciones de pulpa ................................................. .................................................... ....29

III.7. Determinación del contenido fenólico total ............................................... ...................29

III.8. Ensayo químico de capacidad antioxidante ............................................... ....................30

III.9. Análisis de color.................................................. .................................................... .......32

III.10. Ensayo de antioxidantes celulares (CAA) ............................................... ............................33

III.10.a. Preparados de fitoquímicos puros y extractos de pulpa de cacao ................33

III.10.b. Cultivo de células................................................ ...............................................33

III.10.c. Citotoxicidad .................................................. .............................................34

III.10.d. Ensayo de actividad antioxidante celular (CAA) de fitoquímicos puros y

extractos de pulpa de cacao .............................................. ....................................35

III.10.e. Cuantificación de CAA.................................................... ..............................36

III.11. Análisis estadístico ................................................ ..........................................37

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................... .............................38

IV.1. Procesamiento térmico secundario de pulpa de cacao ........................................... .............38

IV.2. Contenido total de fenoles de la pulpa de cacao ............................................... .......................40

viii
IV.3. Capacidad antioxidante química de la pulpa de cacao .................................. .............45

IV.4. Color de la pulpa del cacao .............................................. .................................................... 49

IV.5. Estudio de estabilidad de pulpa de cacao pasteurizado simple y doble ..............................50

IV.5.a. Estudio de estabilidad de pulpa simple pasteurizada ........................................... ......51

IV.5.b. Estudio de estabilidad de la pulpa doble pasteurizada .................................. .....61

IV.6. Actividad antioxidante celular de la pulpa de cacao.................................... .............71

IV.7. Resultados preliminares de análisis de correlación entre química y celular

ensayo de antioxidantes.................................................. .................................................... ..80

v CONCLUSIONES .................................................. .................................................... .82

VI. TRABAJO FUTURO................................................ .................................................... .85

REFERENCIAS .................................................. .................................................... ...............86

viii
 LISTA DE FIGURAS

Figura I.1.a Los frutos del cacao crecen en las ramas y el tronco del árbol del cacao ............ 1

Figura I.1.b En el interior de una mazorca de cacao .............................................. ............................. 1

Figura I.2 Fermentación en caja de los granos de cacao.................................... .......... 6

Figura I.3 Método y principio propuesto de la actividad antioxidante celular

ensayo (CAA) .............................................. ...................................... 15

Figura III.1 Planteamiento esquemático del estudio global ....................................... 24

Figura III.2 Procesamiento térmico configurado para bolsas MRE que contienen pulpa de cacao...

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Figura III.3.a Espacio de color HSL .................................................. ............................. 32

Figura III.3.b Rueda de color de matiz .............................................. ............................. 32

Figura IV.1 Historial de tiempo, temperatura y valor F durante la térmica secundaria

tratamiento de la pulpa de cacao ............................................... ...................... 39

Figura IV.2 Curva estándar de ácido gálico utilizada en los fenoles totales de Folin-Ciocalteu

determinación ................................................. .................................... 41

Figura IV.3 Contenido total de fenoles de pulpa sin pasteurizar y pasteurizada ...... 44

Figura IV.4 Curva de decaimiento de la fluorescencia de Trolox a diferentes concentraciones ..... 45

Figura IV.5 Curva estándar de Trolox utilizada en el ensayo ORAC ................................ 46

Figura IV.6 Capacidad antioxidante de la pulpa sin pasteurizar y pasteurizada .......... 48

Figura IV.7 La estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ ............................. 53

ix
Figura IV.8 La estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa pasteurizada única a

diferentes condiciones de almacenamiento ................................................. ............... 56

Figura IV.9 Diferencia de color general de pulpa pasteurizada individual durante el almacenamiento

estudiar................................................. .............................................60

Figura IV.10 La estabilidad de fenoles totales en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ ............................. 63

Figura IV.11 La estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa doble pasteurizada a

diferentes condiciones de almacenamiento ................................................. ............... 66

Figura IV.12 Diferencia general de color de la pulpa doble pasteurizada durante el almacenamiento

estudiar................................................. ..................................................70

Figura IV.13.AC Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2

y la inhibición de la oxidación por la quercetina en el ensayo CAA ............ 73

Figura IV.14.AC Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2

y la inhibición de la oxidación por pulpa de cacao no pasteurizada en CAA

ensayo................................................. .......................................... 74

Figura IV.15.AC Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2

y la inhibición de la oxidación por pulpa pasteurizada única en CAA

ensayo................................................. .......................................... 75

Figura IV.16.AC Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2

y la inhibición de la oxidación por pulpa doble pasteurizada en CAA

ensayo................................................. .......................................... 76

Figura IV.17.A Curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la inducción de radicales peroxilo

Oxidación de DCFH por quercetina en el ensayo CAA ................................ 77

X
Figura IV.17.B Curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la inducción de radicales peroxilo

Oxidación de DCFH por pulpa no pasteurizada en el ensayo CAA ................ 77

Figura IV.17.C Curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la inducción de radicales peroxilo

Oxidación de DCFH por pulpa pasteurizada simple en ensayo CAA ........... 77

Figura IV.17.D Curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la inducción de radicales peroxilo

Oxidación de DCFH por pulpa doble pasteurizada en ensayo CAA .......... 77

Figura IV.18.A Gráficas de efecto mediano para la inhibición del DCFH inducido por radicales peroxilo

oxidación por quercetina en ensayo CAA .................................................. .. 78

Figura IV.18.B Gráficas de efecto mediano para la inhibición del DCFH inducido por radicales peroxilo

Oxidación por pulpa no pasteurizada en el ensayo CAA........................... 78

Figura IV.18.C Gráficas de efecto mediano para la inhibición del DCFH inducido por radicales peroxilo

oxidación por pulpa pasteurizada simple en ensayo CAA ........................... 78

Figura IV.18.D Gráficas de efecto mediano para la inhibición del DCFH inducido por radicales peroxilo

oxidación por pulpa doble pasteurizada en ensayo CAA .......................... 78

Figura IV.19 Correlación entre ORAC y CAA de extractos de pulpa de cacao ....... 81

xi
 LISTA DE TABLAS

Tabla I.1 Composición de la pulpa de cacao de Costa de Marfil ............................................... .......... 3

Tabla I.2 Concentración de monosacáridos y disacáridos de pulpa de cacao fresco de Costa de Marfil ..... 3

Cuadro I.3 Concentración de pectina, celulosa, hemicelulosa y lignina en liofilizados

Pulpa de cacao de Costa de Marfil ............................................... ........................................ 3

Tabla I.4 Concentración de iones metálicos en pulpa de cacao de Costa de Marfil liofilizada ........... 4

Cuadro I.5 Concentración de vitaminas en una muestra compuesta de cacao liofilizado de Costa de Marfil

pulpa .................................................. .................................................... .......... 4

Cuadro IV.1 Características de color de la pulpa de cacao ............................................... ............... 49

Cuadro IV.2 La estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple a diferentes

condiciones de almacenaje................................................ .......................................... 52

Cuadro IV.3 ANOVA bidireccional de la estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Cuadro IV.4 La estabilidad de la actividad antioxidante en una sola pulpa pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ ...................................... 55

Cuadro IV.5 ANOVA bidireccional de la estabilidad antioxidante en pulpa única pasteurizada 55

Cuadro IV.6 La estabilidad de L*, a* y b* en pulpa pasteurizada única a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ ...................................... 58

Cuadro IV.7 La estabilidad del ángulo de tonalidad (º) en pulpa pasteurizada única en diferentes almacenamientos

condiciones ................................................. .................................................. 59

Cuadro IV.8 La estabilidad del croma en pulpa pasteurizada única en diferentes almacenamientos

condiciones ................................................. .................................................. 59

xi
Cuadro IV.9 La estabilidad de fenoles totales en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ .................................... 62

Cuadro VI.10 ANOVA bidireccional de la estabilidad de fenoles totales en doble pasteurizado

pulpa .................................................. .................................................... ........ 62

Cuadro IV.11 La estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ .................................... sesenta y cinco

Cuadro IV.12 ANOVA de dos vías de la estabilidad antioxidante en pulpa doble pasteurizada 65

Cuadro IV.13 La estabilidad de L*, a* y b* en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ .................................... 68

Cuadro IV.14 La estabilidad del ángulo de tonalidad ( )̊ en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenaje ................................................ ..................................... 69

Cuadro IV.15 La estabilidad de croma en pulpa doble pasteurizada en diferentes almacenamientos

condiciones ................................................. .......................................... 69

Cuadro IV.16 Actividades antioxidantes celulares de quercetina y pulpa de cacao expresadas en

CE50y CAA .................................................. .......................................... 79

XIII
 1

I. REVISIÓN DE LITERATURA

I.1. pulpa de cacao

Pulpa de cacao, como se muestra enFigura I.1.b, es una capa mucilaginosa blanca, que firmemente

envuelve la semilla individual del fruto deTheobroma cacaoplanta (Figura I.1.a). Es

formado durante el desarrollo de la vaina a partir del meristema del endocarpio y constituye aproximadamente

40% del peso de semilla fresca(Biehl y Ziegleder, 2003).

a
pulpa

semilla

Figura I.1 a)Los frutos del cacao crecen en las ramas y el tronco del árbol del cacao.(Salamona, 2010);b)
Dentro de una mazorca de cacao, las semillas de cacao están rodeadas de pulpa blanca. Se
mostró una sección transversal de una semilla de cacao fresca que mostraba su color púrpura
y una capa externa delgada de pulpa de cacao adherida.(http://www.dominican-
republiclive.com/dominican-republic/beauty/the-cacao.html).
 2

1.a. Composición de la pulpa de cacao

Los constituyentes de la pulpa de cacao de Costa de Marfil que se resumen enTabla I.1-5son

buena representación de la composición de la pulpa de cacao de todo el mundo. pulpa de cacao

consiste principalmente en agua, azúcares, ácidos y pectina (Tabla I.1). Los azúcares en la pulpa de cacao son

principalmente sacarosa, fructosa y glucosa (Tabla I.2). La pectina, que le da a la pulpa de cacao una espesa

consistencia, se presenta en aproximadamente 1% en peso fresco (Cuadro I.3). El citrato es

los principales ácidos orgánicos, que afectaban inversamente el pH de la pulpa de cacao. Otros no-

Los ácidos orgánicos volátiles, como los ácidos málico, tartárico y oxálico, son menos del 0,1 % en el cacao.

pulpa(Pettipher, 1986). El mineral más abundante es el potasio (Tabla I.4), mientras que el

La vitamina más abundante es el ácido ascórbico, que constituye el 97% de todas las vitaminas presentes.

(Cuadro I.5). Las concentraciones de esos nutrientes variarán según la influencia de diferentes

cultivares de cacao, madurez, así como regiones de cultivo y, posteriormente, su clima.

Debido a la composición de la pulpa de cacao que es rica en macro y micronutrientes, es un

medio favorable para el crecimiento microbiano y, por lo tanto, un sustrato adecuado para el grano de cacao

fermentación. Con un pH de 3,50-3,80, la pulpa de cacao fresca tiene una combinación de dulce y

sabor ligeramente ácido con una nota de sabor tropical, popular en las regiones productoras de cacao.
 3

Tabla I.1Composición de la pulpa de cacao de Costa de Marfil(Pettipher, 1986).

g/ 100 g pulpa fresca

Agua 82.60
Monosacáridos y disacáridos Polímeros 11.15
de las paredes celulares de las plantas 2.81
Citrato 1.31
Proteína 0.74
Gordo 0,45
Rieles 0.24
vitaminas 0.05
Etanol 0

Tabla I.2Concentración de monosacáridos y disacáridos de pulpa de cacao fresco de Costa de Marfil

(Pettipher, 1986).

g/ 100 g pulpa fresca

sacarosa 4.35
Fructosa 3.80
Glucosa 3.00

Cuadro I.3 Concentración de pectina, celulosa, hemicelulosa y lignina en pulpa de cacao de Costa de
Marfil liofilizada(Pettipher, 1986).

g/ kg peso seco

Pectina 66.1
Celulosa 51.8
hemicelulosa 28.5
Lignina 15.0
 4

Tabla I.4Concentración de iones metálicos en pulpa de cacao de Costa de Marfil liofilizada(Petipher,

1986).

mg/ kg de peso seco

Potasio 12,000
Magnesio 800
Calcio 730
Hierro 230
Sodio 40
Zinc 15
Cobre 6
Manganeso 5
Níquel 2

Cuadro I.5 Concentración de vitaminas en una muestra compuesta de pulpa de cacao liofilizada de Costa de
Marfil(Pettipher, 1986).

µg/ 100 g peso seco

Ácido ascórbico (C) 3,0x105

Piridoxina (B6) 4,0x103
niacina 2,6x103
pantotenato 2,3x103
Riboflavina (B2) 250
Tiamina (B1) 220
Ácido fólico 95
biotina 63
Cianocobalamina (B12) 30
 5

I.1.b. El papel de la pulpa de cacao en la fermentación del grano de cacao

Productos de cacao comercialmente disponibles, como barras de chocolate, bebidas de cacao y

golosinas de chocolate, están hechas de cacao en polvo que se deriva de las semillas (frijoles) de

Theobroma cacaoplanta. Una de las principales medidas de calidad de esos productos es el sabor a cacao,

que se desarrolla a través de una fermentación microbiana de los granos de cacao. En la vieja práctica,

La fermentación del cacao se realizó para ayudar a eliminar la pulpa mucilaginosa y facilitar la

secado para el posterior procesamiento de los granos. Sin embargo, más tarde se supo que durante

fermentación, los microorganismos utilizan la pulpa de cacao para inducir reacciones bioquímicas dentro

los granos para formar precursores de color, sabor y aroma, que determinan la calidad general

de productos terminados de cacao. Aunque los factores genéticos de la variedad de cacao juegan un gran

influencia en la calidad del chocolate producido, sin embargo, los potenciales de sabor solo pueden liberarse

por un proceso de curado adecuado(Schwan y Wheals, 2004). En general, el proceso de fermentación es

indispensable para el desarrollo del sabor y, por lo tanto, la presencia de pulpa de cacao es crucial para

fermentación para proceder.

La fermentación del cacao es un proceso por lotes y suele durar entre 5 y 8 días. Comienza

espontáneamente, ya que las semillas de cacao se extraen de las vainas y la pulpa se extrae accidentalmente.

inoculados con diferentes microorganismos del aire, manos de los trabajadores, cuchillos,

superficie de los contenedores usados para transportar los granos al fermentador, o usados previamente

hojas de plátano que tienen restos de mucílago seco(López y Dimick, 1991). En

En general, el proceso de fermentación se puede hacer de dos maneras; en montones forrados con plátano

hojas o en cajas de madera, un método de fermentación mejorado(Thompson et al., 2001).

Proceso de fermentación que utiliza cajas de madera (Figura I.2) es generalmente adaptado por mayor

fincas Requiere un volumen fijo de granos de cacao en un tamaño de caja específico para lograr
 6

temperatura óptima de la masa a medida que avanza la fermentación. Los contenedores, los llamados sudor

cajas, puede ser una sola unidad o estructurado a partir de una serie de compartimentos más pequeños y

dispuestos en gradas. La caja está construida sobre el nivel del suelo, sobre un desagüe que recoge la pulpa.

sudoración liberada por la degradación del mucílago durante la fermentación. el piso de madera

de la caja tiene huecos que facilitan tanto el drenaje como la aireación. La mezcla se hace por

quitando la pared divisoria entre los compartimentos y paleando los frijoles en el

cuadro adyacente, o en el caso del diseño de niveles, en el cuadro de abajo. Las casillas se llenan dentro

10 cm de la parte superior y cubierto con hojas de plátano o saco de yute para retener el calor y

evitar el secado de la superficie. Como pauta, 1 m3caja de sudor tiene alrededor de 600-700 kg de fresco

granos de cacao con 2-3 mezclas requeridas durante la fermentación.

Figura I.2Fermentación de granos de cacao realizada en cajas de madera.(Becket, 2008).

 7

Durante la fermentación, las levaduras, las bacterias del ácido láctico y las bacterias del ácido acético crecen en

la pulpa en sucesión. Las levaduras son predominantes durante las primeras 24-48 horas de fermentación.

debido a las condiciones favorables de pH de 3.5-4.0, 10-12% de contenido de azúcar y bajo nivel de oxígeno

concentración. Tiene lugar una fermentación alcohólica típica y se agota el ácido cítrico.

provocando un aumento del pH. En esta etapa, las levaduras también producen enzimas pectinolíticas que

degradar la pulpa, que posteriormente ayuda en el drenaje. Con el tiempo, el agotamiento de azúcares y

acumulación de oxígeno, etanol y calor, así como producción de ácido acético a partir del etanol

se vuelven menos adecuados para las levaduras y esto induce el crecimiento de bacterias del ácido láctico. Láctico

Las bacterias ácidas metabolizan aún más el ácido cítrico para liberar ácido acético, ácido láctico y carbono.

dióxido. A medida que los granos se mezclan y la estructura de la pulpa se derrumba, la fermentación

se vuelve aeróbico. Esta mayor aireación conduce a la disminución de las bacterias del ácido láctico.

dominio, y allanando el camino para aumentar la población de bacterias del ácido acético. Ácido acético

la producción aumenta progresivamente y aumenta la oxidación exotérmica del etanol a ácido acético.

la temperatura de la masa de frijol a unos 50ºC al final del día 3. En esta etapa, sólo

Proliferan las bacterias termófilas, aeróbicas, formadoras de esporas y los mohos. Cuando todo el alcohol tiene

se ha agotado y el ácido acético se ha convertido en dióxido de carbono y agua, el

la temperatura de la masa disminuye y, por lo tanto, la fermentación disminuye a partir de entonces. como el

la fermentación ha terminado, los granos se transfieren para su secado.

La difusión de alcoholes, ácido acético, agua, así como otros metabolitos.

producido durante la fermentación a través de la testa de semillas de cacao en los granos induce

muerte del frijol, impidiendo la germinación de la semilla. A medida que los frijoles mueren, las barreras bioquímicas que

Los componentes celulares segregados se descomponen y se inician reacciones enzimáticas. Este

evento finalmente comienza la actividad enzimática para formar precursores de sabor, como libre
 8

aminoácidos, azúcares reductores y ácidos orgánicos. En resumen, bioquímica compleja

Las reacciones entre la pulpa externa y los granos requieren un mantenimiento estricto del pH y

temperatura de la pulpa externa. Este entorno favorable es a su vez propicio para la

actividades microbianas y enzimáticas progresivas, que determinan la calidad final del cacao

frijoles con astringencia y amargor reducidos.

I.1.c. Uso potencial de la pulpa de cacao

Junto con otros subproductos del procesamiento del cacao, como la cáscara de la mazorca de cacao y

cotiledones no fermentados, la pulpa de cacao se puede procesar en productos de valor agregado

(Sujá, 2003). Estos productos podrían convertirse en una importante fuente de ingresos secundarios en

las comunidades productoras de cacao, especialmente cuando la demanda de cacao es baja en el

emerge el mercado internacional o enfermedades inevitables como la escoba de bruja(Días et al.,

2007).

Aunque la pulpa de cacao es un ingrediente esencial para la fermentación del grano de cacao,

una fermentación exitosa no requiere necesariamente toda la pulpa. De hecho, la pérdida de pulpa

ocurre naturalmente cuando las semillas se esparcen y posteriormente la pulpa se escurre por el

cajas de fermentación. Se puede eliminar hasta el 20% de la pulpa (peso de frijol fresco) sin

efectos significativos en el proceso de fermentación y la calidad organoléptica del grano de cacao

(López, 1979). En ciertos cultivares, la remoción parcial de la pulpa de cacao antes de la fermentación ha

hecho a propósito para reducir la alta acidez en los granos de cacao.Biehl y Ziegleder (2003)

encontró que la fermentación ácida fuerte (pH <4.0) produjo granos con menor aroma

potenciales en comparación con la acidez moderada durante la fermentación (pH 5.0-5.5). Esto era

debido a la condición desfavorable para que las enzimas produzcan aminoácidos libres y
 9

oligopéptidos como posibles precursores del sabor.Biel et al. (1989)también sugirió que si el

la relación de volumen de pulpa a semilla se redujo a menos de 0,6 de aproximadamente 1,1-1,3, ácido acético

la producción se redujo significativamente. Se razonó que con una capa de pulpa más delgada,

la fase de fermentación anaeróbica se acorta provocando una sucesión microbiana acelerada,

aumento de la temperatura y aumento del pH en el cotiledón; dando lugar a una rápida progresión de

fermentación en general. Sin embargo, los estudios anteriores proporcionan información de posibles

uso secundario de la pulpa de cacao en productos de valor agregado en lugar de un subproducto descartado.

Varios intentos de utilizar aún más la pulpa de cacao, extraída antes y después del frijol.

fermentación, se han hecho.Días et al. (2007)tuvieron éxito en hacer un vino de frutas

mediante la fermentación de la pulpa de cacao fresco utilizandoSaccharomyces cerevisiaecepa. En Malasia,

la pulpa de cacao se ha utilizado para hacer jugos y jaleas(Junta del Cacao de Malasia, 2004)como lo

contenía una gran cantidad de pectina y azúcar. En Ghana, la pulpa sin fermentar ha sido

formulado en mermeladas(Instituto de Investigación del Cacao de Ghana, 2010). Por otro lado, la pulpa

que se recolecta durante o después de la fermentación, así llamado'sudoración de cacao', ha sido mostrado

(Adams et al., 1982)ser un medio ideal para la producción de alcohol y vinagre. Él

contenía una concentración de etanol que era económicamente factible de recuperar mediante

destilación. Gin y brandy de pulpa de cacao estaban disponibles comercialmente en Ghana

(Instituto de Investigación del Cacao de Ghana, 2010). Sin embargo, la utilización versátil del cacao

pulpa en las aplicaciones antes mencionadas puede ofrecer una prometedora oportunidad de diversificación

para la agroindustria del cacao.

No obstante, la utilización comercial de la pulpa de cacao requerirá la disponibilidad

de pulpa higiénica y de alta calidad a través de un eficiente proceso de extracción. Mecánica y

se han desarrollado métodos enzimáticos para extraer higiénicamente la pulpa del cacao(Schwan
 10

y ronchas, 2004). La extracción de pulpa a gran escala se ha realizado con

despulpadoras disponibles(Bangerter et al., 1993). Tal depulper puede eliminar hasta el 80% por

peso de pulpa basado en el peso de semillas frescas. En cambio, la extracción enzimática del cacao

la pulpa se hace inoculando un cultivo iniciador de levadura y fermentando bajo condiciones controladas.

condiciones.Buamah et al. (1997)informó que el aumento del 60% en el rendimiento de la sudoración fue

obtenido en fermentación controlada en comparación con la fermentación espontánea. Mayoría

y lo que es más importante, el estudio también confirmó que no hubo efectos nocivos en el resultado final.

calidad de los granos de cacao.

Desafortunadamente, en la tendencia actual de la industria alimentaria que está mayormente influenciada por

salud y bienestar, la información sobre los beneficios potenciales para la salud de la pulpa de cacao es

todavía muy limitado. Esto puede dificultar la utilización de valor agregado de la pulpa de cacao en medio

de la competencia con otros productos conocidos ricos en antioxidantes. En cambio, muchos estudios

han sugerido los ventajosos beneficios para la salud de la contraparte de la pulpa de cacao, que

es el grano de cacao, debido a la presencia de epicatequina, catequina y procianidinas(Ken et al.,

2005). Este flavonoide en el grano de cacao se ha explorado aún más para poseer propiedades antioxidantes.

actividad medida usando productos químicos(Adamson et al., 1999)y ensayos biológicos(Noé y

al., 2004). Por lo tanto, con un enfoque similar, la pulpa de cacao será investigada por su

actividad antioxidante química y celular utilizando ensayos comúnmente utilizados en alimentos

aplicaciones como se describe en la siguiente sección.

 11

I.2. Ensayo de medición de antioxidantes

Los antioxidantes son compuestos que pueden proporcionar protección contra la libre

los radicales dañan las estructuras celulares y las macromoléculas. Debido a la

ineficiencia de nuestro sistema de defensa endógeno, se necesitan antioxidantes dietéticos para

superar el estrés oxidativo como la contaminación, el ejercicio, la exposición al humo y la radiación

(Shahidi y Ho, 2007). Los carotenoides y los compuestos fenólicos son los más abundantes.

antioxidantes dietéticos, que se obtienen principalmente de frutas y verduras. Debido a la

importancia del potencial antioxidante de los alimentos, así como de los suplementos dietéticos, la

la necesidad de métodos de medición de antioxidantes confiables y fisiológicamente relevantes son

necesario.Prior et al. (2005)sugirió que los métodos estandarizados de capacidad antioxidante

puede proporcionar orientación para: 1) ensayo adecuado para aplicaciones específicas, 2) significativo

comparación de alimentos u otros productos comerciales, y 3) ofrecer una provisión de calidad

estándares para temas regulatorios y reclamos de salud. Entre los numerosos métodos antioxidantes,

El ensayo químico y de cultivo celular brinda la capacidad de monitorear los antioxidantes en la inhibición

oxidación en un sistema modelo, evaluando los cambios físicos, químicos o biológicos

por medios instrumentales.

I.2.a. Ensayo químico de antioxidantes

En general, el ensayo de antioxidantes químicos se divide en dos categorías, hidrógeno

Mecanismos de transferencia atómica (HAT) y transferencia de un solo electrón (SET). Mientras SOMBRERO-

El sistema basado se basa en la capacidad del antioxidante para apagar los radicales libres por hidrógeno.

donación, el ensayo basado en SET detecta la capacidad del antioxidante para transferir un electrón a

reducir otros compuestos incluyendo radicales, carbonilos y metales. De muchos SOMBRERO-

 12

basados en ensayos, Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC) y Total Radical-trapping

El parámetro antioxidante (TRAP) cumple con más de losidealrequisitos de una norma

ensayo, tales como: 1) la capacidad de medir la química que ocurre en aplicaciones potenciales;

2) utiliza una fuente de radicales fisiológicamente relevante; 3) simple pero repetible y

reproducible; 4) tiene un mecanismo químico definido; 5) adaptable para un alto rendimiento

análisis(Prior et al., 2005). Ambos métodos se han utilizado en un gran número de estudios para

medir la capacidad antioxidante de los alimentos y los compuestos fitoquímicos(USDA ARS,

2007; Banco y Schauss, 2004). Por otro lado, los ensayos basados en SET están bien

representado por el poder antioxidante reductor férrico (FRAP) y el ensayo de reducción de cobre

(CUPRAC). También se han desarrollado combinaciones de ensayos HAT y SET, como

Capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

(DPPH).

A pesar de la ausencia de un método estándar que sea adecuado para una variedad de objetivos

aplicaciones, el ensayo ORAC tiene la capacidad de medir tanto hidrófilos como lipofílicos

capacidad antioxidante en muestras biológicas complejas. El ensayo ORAC fue desarrollado porCao

y anterior (1999). El ensayo mide la capacidad del antioxidante para eliminar el peroxilo

radical inducido por diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-amidinopropano) (AAPH) a 37ºC. β-

La ficoeritrina (β-PE) se utilizó inicialmente como sonda de fluorescencia en este ensayo. Sin embargo,

debido a su susceptibilidad al fotoblanqueo, se reemplazó por una sonda más estable,

fluoresceína(Ou et al., 2001). La pérdida de fluorescencia de la sonda se utiliza como índice

del daño oxidativo por su reacción con los radicales peroxilo. El efecto protector de la

el antioxidante se cuantificó midiendo el área bajo la curva (AUC) de las muestras

en comparación con las concentraciones conocidas de Trolox, un análogo de la vitamina E soluble en agua, después de
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13

resta del blanco, en el que no está presente ningún antioxidante. El ensayo ORAC proporciona una

evaluación completa de la capacidad antioxidante basada en el tiempo de inhibición y la inhibición

grado a medida que la reacción se completa. Por lo tanto, el ensayo ORAC puede proporcionar

mejor información en comparación con los métodos basados en un punto de tiempo fijo y especialmente adecuado

para evaluar diferentes antioxidantes o sistemas de mezclas que tienen diferentes cinéticas de reacción.

Además, el ensayo ORAC se ha automatizado para aplicaciones de alto rendimiento(Antes y

al., 2003). No obstante, el ensayo es altamente sensible a la temperatura en el que la reproducibilidad

del ensayo puede disminuir a menos que esté bien controlado(Huang et al., 2002).

I.2.b. Ensayo de antioxidantes celulares (CAA)

El ensayo de antioxidantes celulares (CAA) se desarrolló debido a la incapacidad de la 'prueba

Ensayos de antioxidantes químicos de tubo para reflejar las condiciones fisiológicas, así como

problemas de biodisponibilidad y metabolismo(Wolfe y Liu 2007). Esta disparidad puede deberse a

variabilidad en la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) de bioactivos

componentes que se descuidan en muchosin vitrométodos(Shahidi y Ho, 2007). Otro

discrepancias entreen vivoyin vitrotambién se han observado a través de estudios que

sugirió que los compuestos bioactivos originales pueden no exhibir actividad antioxidanteen

vivossino más bien sus metabolitos(Scalbert y Williamson, 2000). animal y humano

los estudios, por otro lado, a menudo consumen mucho tiempo y limitan financieramente a

comprender la complejidad de la química del metabolismo de los polifenoles. Con la necesidad de puentear

El espacio entreen vivoyin vitroensayo antioxidante, CAA permitiría simple y

método rápido para comprender la absorción de fitoquímicos en relación con la matriz alimentaria,
 14

procesamiento, estructuras de compuestos bioactivos, así como interacciones con otros

componentes

CAA comparte un principio similar con ORAC. Mide la capacidad de las muestras para

eliminar los radicales libres, como se muestra enFigura I.3. En este método, los compuestos antioxidantes,

generadores de radicales y diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA o C24Hdieciséiscl2O7), cual

es una sonda fluorescente, es captada por células de hepatocarcinoma humano HepG2. como DCFH-

DA entra en las células, las esterasas celulares escinden el resto de diacetato para formar el más

DCFH polar, que queda atrapado dentro de la célula. Los radicales peroxilo que se generan a partir de

la descomposición de los generadores de peroxilo ABAP (2,2'-azobis-2-amidinopropano) conducen a

la oxidación de DCFH a DCF (C20H10cl2O5), que emite fluorescencia. Por lo tanto, la

el nivel de fluorescencia es proporcional al grado de oxidación. La presencia de

Los fitoquímicos en los alimentos apagarán los radicales peroxilo e inhibirán la generación de DCF,

que posteriormente reduce la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, el ensayo CAA utiliza la capacidad

de radicales peroxilo reactivos para inducir la formación de una respuesta fluorescente como resultado

del estrés oxidativo en cultivo celular, y mide la capacidad de los antioxidantes para prevenir

oxidación.

En el ensayo CAA, es necesaria una selección adecuada de cada componente para

imitar los sistemas biológicos. Se utilizan células HepG2 ya que son un mejor modelo para simular

y abordar los problemas del metabolismo. En comparación con otras líneas celulares, incluidas las células Caco-2

y RAW 264.7, se puede obtener un coeficiente de variación más bajo usando células HepG2(Lobo

et al., 2008). DCFH-DA se utiliza en este ensayo debido a su rápida absorción y final estable

concentraciones(Royall y Ischiropoulos, 1993). Además, la amplia gama de ROS

(Especies Reactivas de Oxígeno) que son capaces de oxidar DCFH a su DCF fluorescente, le ofrece
 15

como una técnica versátil para medir el estrés oxidativo general en las células. ABAP es radical

iniciador utilizado como fuente de oxidante en muchos métodos de actividad antioxidante. Estudio previo

ha demostrado que ABAP es capaz de inducir la formación de DCF en cultivo celular en una dosis-

manera dependiente(Wang y José, 1999). A pesar de que ABAP en sí mismo no es un

compuesto fisiológicamente relevante, sus productos de descomposición son una de las principales ROS in vivo.

Por lo tanto, es útil para examinar los daños a las membranas y otras moléculas biológicas debido

a los radicales peroxilo, y respectivamente, los efectos de inhibición por los antioxidantes(Frankel y

Mayer, 2000). Para estandarizar CAA,Wolfe y Liu (2007)quercetina recomendada para ser

utilizado como estándar debido a: 1) su alta actividad CAA en comparación con otros

fitoquímicos; 2) su forma pura que se puede obtener económicamente; 3) es omnipresente

presencia en frutas, verduras y otras plantas; y 4) su estabilidad química.

Figura I.3Método y principio propuesto del ensayo CAA(Wolfe y Liu, 2007).

 dieciséis

Se ha informado que los CAA evalúan la actividad antioxidante de las frutas.(Wolfe et al.,

2008),verduras(Canción et al., 2010)común en la dieta estadounidense, leche de soya procesada(Xu

et al., 2010)y brócoli(Eberhardt et al., 2005). En conjunto con antioxidante celular

ensayo, otro estudio también utilizó monocapas de células Caco-2 para evaluar las diferencias en

biodisponibilidad entre alimentos(Boyer et al., 2004). El estudio presentó un modelo útil para

comparar la absorción de quercetina aglicona y quercetina-3-glucósidos cuando se aplica como

compuestos puros en comparación con los extractos obtenidos de cebolla y manzana. si o

no CAA es mejor que los ensayos de antioxidantes químicos para predecir la actividad biológica de

los antioxidantes quedan por ser probados poren vivoestado antioxidante después del consumo de

muestras que contienen antioxidantes(Wolfe y Liu, 2007).

I.3. Actividad antioxidante afectada por el procesamiento térmico

En las aplicaciones a base de frutas, un factor que afecta en gran medida la actividad antioxidante es

el paso de procesamiento térmico. El procesamiento se realiza para garantizar el consumo seguro de los

alimentos y prolongar su vida útil para satisfacer los requisitos de distribución. Sin embargo, térmica

tratamiento también puede conducir al deterioro de la actividad antioxidante debido al calor adverso

exposición. Por el contrario, en algunos casos, el procesamiento térmico puede aumentar la actividad antioxidante.

debido a la liberación de compuestos que poseen actividad antioxidante desde las matrices celulares.

Para el propósito de esta tesis, sólo el procesamiento térmico común adecuado para no clarificado,

Los productos pulposos a base de frutas se revisarán para representar muchos procesos y

métodos de conservación disponibles para prolongar la vida útil de la pulpa de cacao, posiblemente sin la

uso de aditivos.
 17

I.3.a. Procesado térmico de productos a base de frutas

El interés de utilizar la pulpa de cacao como producto de valor agregado a gran escala lo requiere

ser manipulado inmediatamente para evitar su corta vida útil a temperatura ambiente debido a

Fermentación alcohólica por microorganismos. Procesamiento térmico económicamente factible

que garantiza la seguridad pero también mantiene las características nutricionales y sensoriales, es

deseado. Por lo tanto, el diseño de cualquier tipo de procesamiento térmico debe cumplir con los siguientes

tres criterios básicos(Becarios, 2000):

1. Reducir el número de microorganismos patógenos y de deterioro a un nivel

nivel aceptable que ya no son una preocupación de peligro para la salud pública,

2. Para crear un entorno de paquete interno que suprima el crecimiento y

actividad de los microorganismos del deterioro,

3. Para evitar la recontaminación posterior al procesamiento y durante el almacenamiento.

Es importante entender que el procesamiento térmico está destinado a lograr la estabilidad en almacenamiento

pero no la esterilidad de los productos alimenticios. De hecho, producir un producto seguro a expensas de

la calidad nutricional y alimentaria nunca es una opción.

Uno de los métodos más comunes de procesamiento térmico de productos a base de frutas,

como los jugos, es la pasteurización. Es un tratamiento térmico suave en el que los jugos se calientan para

rango de temperatura objetivo de 60-90ºC. En la técnica tradicional de pasteurización por lotes,

Llamado proceso Holder, los jugos se mantienen a unos 60ºC durante un período relativamente largo de

tiempo (~30 minutos) en una bandeja abierta y luego se llenan en caliente en recipientes, sellados y

invertida, esterilizando así la parte superior de los envases y tapas(Lewis, 2006).Este

El tipo de proceso de llenado en caliente es simple y adecuado para productos a base de frutas con pH inferior a 4,

ya que la alta acidez impide el crecimiento deClostridium botulinum, un patógeno que

 18

puede producir la toxina botulínica mortal. También tiene las ventajas adicionales de crear

un vacío parcial en el recipiente sellado a medida que el vapor se condensa al enfriarse. Desafortunadamente,

No se puede obtener un enfriamiento rápido con este método y, por lo tanto, se quema debido a la

período de espera prolongado antes y después del llenado(Bates et al., 2001).

Luego se introdujo la pasteurización HTST (High Temperature Short Time) para

mejorar la calidad del producto terminado. Ejecutar de manera continua, este tipo de procesamiento

La operación ofrece una serie de ventajas, como velocidades de calentamiento y enfriamiento más rápidas, menor

tiempos de retención y regeneración, lo que ahorra costos de calefacción y refrigeración y

contribuye a los bajos costos de procesamiento incurridos en el procesamiento térmico. en gran escala

pasteurización de líquidos de baja viscosidad, como jugos de frutas, los intercambiadores de calor de placas son

generalmente empleado. Los intercambiadores de calor de placas se componen de una serie de delgados tubos verticales de acero inoxidable.

placas de acero que se mantienen juntas en un marco de metal. Las placas crean paralelo

Canales por los que se bombean los jugos y el medio de calentamiento, vapor o agua caliente.

canales alternos en forma de flujo a contracorriente. Mezcla del producto y el

se evitan los medios de calentamiento o enfriamiento ya que las juntas de caucho sintético están instaladas

que cada placa esté sellada herméticamente. Las placas están corrugadas para inducir turbulencia en el

líquidos, así como para reducir el ensuciamiento debido a la velocidad inducida por el bombeo. En la práctica,

el jugo se bombea primero a una sección de regeneración, donde es precalentado por el jugo que ha

recién pasteurizado. Luego se calienta a la temperatura de pasteurización deseada y se

período de retención en el tubo de retención. A continuación, el producto pasteurizado se enfría gradualmente, primero

a través de la sección de regeneración y luego enfriado por agua fría en el enfriamiento

sección. Para jugos más viscosos, se sugiere el uso de intercambiadores de calor de tubos concéntricos.

El sistema consta de una serie de bobinas concéntricas de acero inoxidable que están hechas de
 19

tubo de doble o triple pared. El jugo pasa a través del tubo y el calentamiento o enfriamiento

el medio se recircula a través de las paredes del tubo. Después de la pasteurización, el jugo es inmediatamente

llenado en contenedores, sellado y refrigerado hasta su consumo(Becarios, 2000).

Para reducir el costo de refrigeración durante el manejo y almacenamiento, la esterilización por calor

proceso fue desarrollado. Los jugos esterilizados, como resultado, tienen una vida útil de más de 6

meses a temperatura ambiente. La esterilización en el contenedor se realiza comúnmente usando un

proceso de réplica. Con el medio de calentamiento de vapor saturado, mezclas de vapor y aire, o caliente

agua (con presin predominante), el proceso podra ser por lotes o continuo, acoplado

con modo estático o de agitación. Investigación exhaustiva de la resistencia al calor del objetivo.

microorganismos, tamaño y tipo de envase, la transferencia de calor de los alimentos debe hacerse para

acortar el tiempo de procesamiento. Esos factores críticos también aumentarán la eficiencia del proceso.

como la inocuidad, calidad nutricional y sensorial en el producto terminado(Ramaswamy et al.,

2004).

Para bebidas, purés y jugos de frutas que contengan partículas discretas, asépticas o

El procesamiento de ultra alta temperatura (UHT) se ha convertido en una opción viable para mejorar el producto.

calidad de los alimentos procesados térmicamente y no perecederos. Brevemente, la esterilización del producto es

logrado por calentamiento rápido a temperaturas de unos 140ºC, manteniendo durante varios segundos,

seguido de un enfriamiento rápido. En este proceso se esterilizan los jugos y los materiales de empaque.

por separado y luego ensamblados en condiciones estériles(Lewis 2006). Aunque directo

Los métodos de calentamiento están disponibles, método indirecto de calentar jugos usando placa o tubular.

Los intercambiadores de calor se utilizan ampliamente. No obstante, el procesamiento aséptico es costoso

que requiere un sofisticado sistema de operación, mantenimiento y personal capacitado.

 20

I.3.b. Efecto del procesamiento térmico sobre la calidad sensorial y nutricional de los frutos a base de

productos

Aunque el tratamiento térmico sigue siendo el método más importante de alimentos

procesamiento, el calor destruye algunos componentes en los productos a base de frutas que son responsables

color, aroma, sabor, textura y valores nutricionales. Deterioro del color en pasteurizados

jugos de frutas es causado principalmente por el pardeamiento enzimático. La inactivación de la actividad enzimática puede

lograrse a través del procesamiento térmico y, a menudo, complementarse con desaireación

antes de la pasteurización para minimizar la actividad enzimática durante el procesamiento(Becarios, 2000).

También se observó pardeamiento debido a una vía no enzimática en el puré de durazno durante

calefacción(Garza et al., 1999). A menudo, debido al tratamiento térmico, la clorofila se convierte en

feofitina cuando se calienta por encima de 60ºC(Weemaes et al., 1999), los carotenoides se isomerizan

de 5,6-epóxidos a 5,8-epóxidos de colores menos intensos(Lee y Coates, 2003), y

las antocianinas se degradan para formar pigmentos marrones a través de la polimerización(Boyles y

Wrolstad, 1993).

También se ha observado una pérdida de volátiles en los jugos, lo que lleva al desenmascaramiento de

sabores cocidos.Yen y Lin (1999)mostró que el calentamiento a 95ºC durante 5 min provocó la pérdida

de la mayoría de los sabores en el jugo de guayaba. Estos compuestos volátiles que se pierden durante la temperatura

tratamiento o evaporación puede recuperarse mediante destilación, condensación parcial y

pervaporación(Pereira et al., 2006)ser añadido de nuevo para conservar la calidad sensorial de

jugos Sin embargo, debido a su alto costo, esta práctica no es ampliamente adoptada.

Los delicados jugos de sabor fresco se alteran fácilmente con el tratamiento térmico. La diferencia

en el perfil de jugos de naranja recién exprimidos y jugos reconstituidos pasteurizados de

 21

concentrado ha sido comparado cuantitativamente porNísperos-Carriedo y Shaw (1990).

El estudio mostró que los jugos pasteurizados de concentración simple (no concentrados) no mostraron

diferencias en el perfil de sabor en comparación con el jugo fresco. Por el contrario, pasteurizado

jugos reconstituidos de concentrado mostraron disminuciones en acetaldehído, acetato de metilo,

butirato de metilo y butirato de etilo, contribuyentes prominentes a los sabores de frutas de "nota superior"

especialmente en cítricos frescos.

La influencia de los procesos térmicos en la viscosidad de los jugos de frutas, dilución y

espesamiento, depende mucho de la composición(Heldman y Hartel, 1997)semejante

como contenido de sólidos solubles.Yen y Lin (1998)descubrí que el jugo de guayaba pasteurizado

mostró una disminución significativa en la viscosidad y un aumento en la turbidez. Esas observaciones

se debieron a la degradación de la sustancia péctica que se agregó y condujo al aumento de

el contenido de la nube. Un resultado similar también fue obtenido porFarnworth et al. (2001)en naranja

jugos

Además de la etapa de madurez y los tipos de cultivo de frutas, los componentes bioactivos en

los jugos de frutas están fuertemente influenciados por el procesamiento y almacenamiento posterior a la cosecha. En térmicamente

jugos de frutas procesados, pueden ocurrir pérdidas significativas en vitaminas termolábiles, solubles en agua,

particularmente ácido ascórbico. Se observó una pérdida inevitable de ácido ascórbico de 2-6% en negro

néctares de grosella(Iversen, 1999)y hasta un 25% en maracuyá amarilla(Talcott et al., 2003)

post pasteurización. Por lo tanto, el ácido ascórbico se usa a menudo como marcador de cambios de calidad.

en frutas y verduras debido a la severidad del procesamiento de los alimentos. Otro estudio(Gil-Izquierdo

et al., 2002)sin embargo encontró que no hubo una disminución significativa de ácido ascórbico en

jugo de cítricos después del procesamiento. El bajo pH de las frutas proporcionó el efecto protector para la

estabilidad del ácido ascórbico durante el procesamiento térmico.

 22

Compuestos polifenólicos de frutas beneficiosos que inhiben las reacciones oxidativas(Chun y

al., 2005)también se vieron afectados por el procesamiento térmico en combinación con la luz y el oxígeno

(Rickman et al., 2007). Estudios en melocotón clingstone porAsami et al. (2003)mostró que

el procesamiento por encima de 220ºF durante 10 minutos mostró una disminución en los fenoles totales de hasta

21%. El estudio también reveló que se produjo una pérdida del 30% al 43% en el contenido de fenoles durante el

primeros 3 meses de almacenamiento después del enlatado. La misma tendencia también se observó en aclarado

Jugo de mora(Hager et al., 2008). La pasteurización a 90ºC durante 3 minutos provocó el 67%

disminución de la antocianina monomérica total, así como una disminución del 55% en antioxidantes

actividad medida usando el ensayo ORAC. En cambio, el maíz dulce tratado térmicamente (115ºC, 25

minutos) y los tomates (88ºC, 15 minutos) tenían un 44% y un 34% más

actividad antioxidante, respectivamente(Dewanto et al., 2002a; Dewanto et al., 2002b). Térmico

Se sugirió el tratamiento para romper las membranas celulares y las paredes celulares, liberando así

fitoquímicos, lo que a su vez aumenta su bioaccesibilidad y absorción.

 23

II. OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN

II.1. Objetivos

Los objetivos del estudio son los siguientes:

- Para cuantificar el contenido fenólico total de la pulpa de cacao sin procesar y pasteurizada,

• Cuantificar la capacidad antioxidante química de productos no procesados y pasteurizados.

pulpa de cacao utilizando el ensayo de Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC),

• Cuantificar la capacidad antioxidante celular de productos no procesados y pasteurizados.

pulpa de cacao utilizando el método de ensayo de antioxidantes celulares (CAA),

• Estudiar la estabilidad de los fenoles, la capacidad antioxidante y el color del cacao

pulpa después de la pasteurización y durante el almacenamiento en comparación con la pulpa sin procesar.

II.2. Razón fundamental

Los resultados de este estudio proporcionan información beneficiosa sobre el potencial

Beneficios para la salud de la pulpa de cacao que respaldarán su utilización en productos de valor agregado. El

éxito en la comercialización y comerciabilidad de la pulpa de cacao, incorporada en

conjuntos de productos de valor agregado, brindará una oportunidad de diversificación para el cacao

industria. Además, comprender el efecto del procesamiento térmico en la

El perfil de nutracéuticos de la pulpa de cacao ayudará a prolongar su vida útil y mantener su clave

atributos nutricionales y sensoriales. Los resultados de esta investigación serán de utilidad para

una mayor utilización de la pulpa de cacao en otros productos de consumo, lo que puede aumentar su valor

y comerciabilidad.
 24

tercero MATERIALES Y MÉTODOS

III.1. Planteamiento esquemático del estudio.

La estrategia general del estudio se muestra enFigura II.1abajo. sin pasteurizar

y la pulpa pasteurizada se obtuvo del proveedor. La doble pasteurización se realizó por

pasteurizar la pulpa de cacao ya pasteurizada. Todas las muestras de pulpa de cacao, sin procesar,

pulpa simple y doble pasteurizada, fueron sometidos a fenoles totales, químicos y

capacidad antioxidante celular y determinación del color. Estudios de estabilidad de ocho semanas en

Se realizaron 4ºC, 25ºC y 37ºC para monitorear la estabilidad de fenoles totales, químicos

valores antioxidantes y color de la pulpa de cacao.

Figura III.1Planteamiento esquemático del estudio global.

 25

III.2. Lista de productos químicos utilizados

Los productos químicos enumerados se utilizaron en los siguientes procedimientos:

a. Extracción:

- Acetona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Ácido acético (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)

b. Ensayo de Folin-Ciocalteu:

- Ácido gálico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Carbonato de sodio (Na2CO3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- polivinilpolipirrolidona (PVPP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

C. Ensayo de Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC):

- Dihidrocloruro de 2,2'-azobis-2-amidinopropano (AAPH o ABAP) (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO)

- Fluoresceína (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Fosfato de sodio dibásico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Fosfato de sodio monobásico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO)

 26

d. Ensayo de actividad antioxidante celular (CAA):

- Diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis,

MES)

- Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Hepes (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Hidrocortisona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Insulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- Quercetina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

- 0,25 % de tripsina-EDTA (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)

- Suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)

- Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)

- Penicillium-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA)

- Medio E de Williams (WME) (Invitrogen, Carlsbad, CA)

- Ensayo de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega,

Madison, WI)

- Células HepG2 (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD)

III.3. Muestras de pulpa de cacao

La pulpa de cacao, sin pasteurizar y pasteurizada, se obtuvo de Quicornac

(Guayaquil, Ecuador) a través de iTi Tropicals, Inc. (Lawrenceville, NJ).

 27

III.4. Procesamiento térmico de pulpa de cacao

La pulpa de cacao pasteurizada que recibimos de Quicornac ya estaba

procesado a 85ºC a 60 s. Para simular la práctica en la industria, térmica secundaria

el procesamiento de la pulpa de cacao se realizó envasando la pulpa ya pasteurizada en bolsas

y sumergirlos en agua caliente (85ºC) contenida en una marmita con camisa de vapor como

ilustrado enFigura III.2. Para una tasa de transferencia de calor más rápida, cada 30 g de pulpa de cacao se

envasado al vacío en una bolsa Meals Ready to Eat (MRE) con unas dimensiones de 10 x 12 cm

utilizando una selladora al vacío ULTRAVAC de mesa (Koch Equpment LLC, Kansas City, MO).

La bolsa MRE es un envase flexible y esterilizable de ración de campo individual que consta de

de poliéster (0,030 mm), lámina de aluminio (0,045 mm), poliamida orientada biaxialmente (0,015

mm), y polipropileno no orientado (0,075 mm) sucesivamente desde el exterior al

capa superficial interna de contacto con los alimentos. El grosor promedio de las bolsas llenas fue

aproximadamente 5 mm.

Se prepararon aproximadamente 100 bolsas y se colocaron entre las espirales de un

estirado slinky, que se adjuntó en una cesta de alambre de metal. Una bolsa ubicada en el

centro geométrico de la cesta, que se encuentra en el punto de menor velocidad de calentamiento, tenía un

Termopar Ecklund flexible C-4 conectado a él. Este tipo de termopar está diseñado

para realizar pruebas de penetración de calor de alimentos en latas, frascos y envases de plástico flexible.

Luego, el termopar se conectó a un sistema de adquisición de datos, que consistía en un

USB de alta velocidad de carrera NI USB9162 (National Instruments, Austin, TX) conectado a un

ordenador portátil. Vista de laboratorio 7®(National Instruments, Austin, TX) se utilizó para grabar

tiempo, datos de temperatura y calcular valores F. Basado en el pH de la pulpa de cacao (~pH

3.80), la temperatura de referencia utilizada para este procesamiento térmico fue de 200ºF (93.33ºC)
 28

y valor z de 16ºF (8,8ºC)(Fundación de Ciencia y Educación GMA, 2007). Por lo tanto, la

cesta llena se sumergió en el agua caliente para llegar a 85ºC, y el procesamiento térmico

se detuvo cuando el valor F calculado, que se muestra en la pantalla, alcanzó los 6 s. El

El proceso de enfriamiento se inició descargando el agua caliente y vertiendo una mezcla de

agua fría y hielo en el hervidor al mismo tiempo. La canasta fue removida del

hervidor cuando la temperatura esté cerca de la temperatura ambiente (22ºC).

Figura III.2Procesamiento térmico configurado para bolsas MRE que contienen pulpa de cacao.
 29

III.5. Estudio de almacenamiento

Se seleccionaron tres temperaturas de almacenamiento, 4ºC, 25ºC y 37ºC, para estudiar la

estabilidad de fenoles, actividad antioxidante y color de la pulpa de cacao. Temperatura

En este estudio de almacenamiento se utilizaron cámaras controladas para almacenar bolsas de pulpa pasteurizada.

Los análisis se realizaron cada dos semanas y las muestras se controlaron durante un máximo de 8 semanas.

III.6. Extracciones de pulpa

Los extractos se obtuvieron de la pulpa usando un solvente extractor de

acetona/agua/ácido acético (70:29.5:0.5, v/v), como se describe porPrior et al. (2003). Brevemente, en

por triplicado, la pulpa de cacao se sometió a un procedimiento de extracción de dos pasos usando 1:3 (p/v) y

Proporciones de pulpa a disolvente de 1:1,5 (p/v), respectivamente. En ambos pasos de extracción, las muestras fueron

se agitó continuamente a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, los homogeneizados se centrifugaron

a 5000 g durante 10 min. El sobrenadante obtenido de los dos pasos de extracción se

combinados, y sometidos al contenido total de fenoles, así como a la química y celular

medición de la capacidad antioxidante.

III.7. Determinación del contenido fenólico total

El contenido de fenoles totales se determinó mediante el método de Folin-Ciocalteu con

ácido gálico como estándar(Singleton et al., 1999; Dewanto et al., 2002b). Varios ácido gálico

Se prepararon muestras con un rango de concentraciones de 50-600 μg de ácido gálico/ml para desarrollar

la curva estándar y la lectura de absorción de los extractos de pulpa sin diluir cayeron dentro

ese rango de concentración de la curva estándar. Para cada análisis, 125 μl de solución de ácido gálico
 30

o se añadió extracto de pulpa a 3,25 ml de agua desionizada. Luego, 125 μL de Folin-Ciocalteu

Se añadió el reactivo y se agitó la muestra. A continuación, 1 ml de sodio al 7 %

Se añadió solución de carbonato. Después de 30 min a temperatura ambiente, la intensidad de la

el color azul desarrollado se midió a 745 nm frente al blanco preparado usando un Cary 50

Espectrofotómetro UV-Vis (Varian, Palo Alto, CA). Las lecturas de absorbancia de

las muestras obtenidas se interpolaron luego a las curvas estándar y se expresaron como mg

equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 g de pulpa ± error estándar (SE) para tres repeticiones.

Debido a la presencia de otros compuestos que interfieren, como azúcares y ácido ascórbico

ácido, que podría sobreestimar la medición del contenido de fenoles totales, corrección

se hizo(Makkar et al., 1993)mediante la unión de extractos a polivinilpolipirrolidona (PVPP).

PVPP es un adsorbente y precipitante de compuestos fenólicos, dejando así

compuestos que interfieren en las porciones no adsorbidas o no precipitadas. Así, extractos post-

La unión de PVPP explica la absorbancia de los compuestos que interfieren. El procedimiento

para la unión de PVPP es la siguiente: el extracto agrupado se sometió a 4% (p/v) de PVPP

unión durante 1 h a 22ºC y centrifugación durante 10 min. Los fenoles totales corregidos

Los valores se obtuvieron mediante la resta de los valores de fenoles totales después de la unión de PVPP del

valores iniciales de fenoles totales (unión pre-PVPP).

III.8. Ensayo de capacidad antioxidante química

Se realizaron mediciones de capacidad antioxidante para pulpas no pasteurizadas y pasteurizadas.

hecho usando un ensayo modificado de Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC) de acuerdo con

(Ou et al., 2001). Brevemente, se prepararon soluciones y extractos y se diluyeron más

apropiadamente utilizando tampón fosfato 75 mM a pH 7,4, que también se utilizó como blanco.
 31

400 μL de extractos o blanco o solución Trolox (como estándar) con un rango de concentración

de 6,25-50 μM, se mezclaron con 2,4 ml de solución madre de fluoresceína 0,08 μM 1:1000 en un

cubeta de sílice. La mezcla se mezcló con la ayuda de una barra microagitadora, se incubó y

equilibrado a 37ºC durante 5 min. A continuación, las reacciones se iniciaron mediante la adición de 400 μl

de 153 mM AAPH a la cubeta individual. La fluorescencia se controló cinéticamente

utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (Varian, Palo Alto, CA) cada 30

segundos con longitud de onda de excitación de 485 nm, ancho de rendija de excitación de 20 nm, y

longitud de onda de emisión de 540 nm, ancho de rendija de emisión de 20 nm. La reacción se detuvo

cuando la intensidad de la fluorescencia estaba por debajo del 2% de la señal de fluorescencia inicial. ORAC

Luego, los valores se obtuvieron interpolando el área neta bajo la curva (AUC) de los extractos,

contra una curva estándar de AUC neta de diferentes concentraciones de Trolox. trapezoidal

se utilizó el método para derivar el AUC. La fórmula para AUC y AUC neta es la siguiente:

ABC = (0.5 + f2/F1+ f3/F1+ f4/F1+ f5/F1+ … + fnorte/F1) × CR

AUC neto = AUCextractos– ABCblanco

donde f1es la intensidad de fluorescencia al inicio de la reacción, fnortees la fluorescencia

señal medida en el último ciclo, y RC es el período del ciclo de lectura de fluorescencia

intensidad medida en minutos. Los valores ORAC se calcularon como μmol Trolox equivalente/

100 g de pulpa (μmol TE/g) ± error estándar (SE) para tres repeticiones.
 32

III.9. Análisis de color

La medición del color de la pulpa de cacao se realizó con una Konica Minolta CR-400

medidor de crominancia basado en los parámetros de color CIE L a*b* (CIELAB) adoptados por el

Comisión Internacional de Iluminación (generalmente abreviada como CIE por su francés

nombre, Commission Internationale de l'éclairage). El colorímetro se estandarizó usando

una placa de calibración blanca (CR-A43). El color se expresó como luminosidad, ángulo de matiz y

saturación/croma(Wrolstad et al., 2005)representado en Tono-Saturación-Ligereza (HSL)

espacio de color mostrado enFigura III.3.a. Los valores L* representan la ligereza de la pulpa, en

donde 100 significa blanco absoluto y 0 indica negro absoluto. El ángulo de matiz se derivó

a partir de los valores a* y b*, calculados como arctan (b*/a*). El ángulo de tonalidad se expresó en un

Cuadrícula de 360˚ (Figura III.3.b), donde 0̊ = rojo azulado, 90̊ = amarillo, 180̊ = verde y 270˚=

azul. La saturación se calculó como (a* + b*)½. Diferencia de color total, ΔE*, obtenido de

0 *)2+ (un*- a*02) + (b*- b* 20½

Ecuación de Hunter-Scotfield: [(L*-L ) ] se calculó para obtener

diferencia de color general antes y después de la pasteurización.

a. b.

Figura III.3 a)espacio de color HSL;b)Rueda de color de tono

(http://www.diaginc.com/iq/colorspace.html).
 33

III.10. Ensayo de antioxidantes celulares (CAA)

Todos los pasos del ensayo CAA realizados fueron de acuerdo conWolfe y Liu (2007),

con la excepción del ensayo de citotoxicidad. Los detalles son los siguientes:

III.10.a. Preparados de fitoquímicos puros y extractos de pulpa de cacao

Una solución madre 10 mM de dihidrato de quercetina, como estándar de CAA, fue recién

hecho en DMSO antes de su uso. Se preparó una solución madre de DCFH-DA 20 mM en

metanol, alicuotado y almacenado a -20ºC. Una solución madre 200 mM de ABAP en agua se

alicuotado y almacenado a -40ºC. Extractos de pulpa obtenidos de la secciónII.6se evaporaron a

secado al vacío a 50ºC. Luego, los residuos se reconstituyeron en DMSO y se almacenaron

a -40ºC. La dilución adicional de fitoquímicos puros y el extracto de pulpa reconstituida fueron

realizado en medio de tratamiento (WME suplementado con L-glutamina 2 mM y 10 mM

Hepes). Las soluciones de tratamiento final contienen menos del 2% de solvente, lo que no mostró

efecto citotóxico a las células HepG2.

III.10.b. Cultivo de células

Las células HepG2 se cultivaron en un medio de crecimiento que consistía en WME que se

suplementado con FBS al 5 %, Hepes 10 mM, L-glutamina 2 mM, insulina 5 µg/ml, 0,05

hidrocortisona µg/ml, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 µg/ml. Las células HepG2 fueron

mantenido a 37ºC y 5% CO2. Las células utilizadas en el estudio estaban entre los pasajes 12 y

24
 34

III.10.c. citotoxicidad

La citotoxicidad se realizó con CellTiter 96® AQueous One Solution Cell

Ensayo de proliferación (Promega, Madison, WI), que se compone de soluciones de

compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-

sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones

(metosulfato de fenazina) PMS. MTS se biorreduce en un producto de formazán que es

soluble en medio de cultivo de tejidos debido a la actividad de la enzima deshidrogenasa producida por

células metabólicamente activas. La cantidad de formazán formada medida a través de su

la absorbancia a 490 nm es directamente proporcional al número de células vivas en cultivo.

Brevemente, las células HepG2 se sembraron a 6x104/pocillo en placas de 96 pocillos en 100 µl de crecimiento

medio e incubado durante 24 h a 37ºC. Se eliminó el medio de cultivo y las células

se lavaron con PBS. 100 µl de medio de tratamiento (WME con L-glutamina 2 mM y

Luego se aplicaron Hepes 10 mM), que contiene fitoquímicos puros o extractos de pulpa.

a las células seguido de incubación a 37ºC y 5% CO2durante 1 h. Después de la incubación, 20 µl de

CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent se añadió a cada pocillo de los 96 pocillos

placa de ensayo sin retirar el medio de tratamiento. La placa se incubó durante 90 min.

a 37ºC y 5% CO2; y se midió su absorbancia a 490 nm. concentraciones de puro

fitoquímicos o extractos de pulpa que disminuyeron la absorbancia en un 10% en comparación con el

los pocillos de control (que sólo contienen medio de tratamiento) se consideraron citotóxicos.
 35

III.10.d. Ensayo de actividad antioxidante celular (CAA) de fitoquímicos puros y

extractos de pulpa de cacao

Las células HepG2 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6 x 104/ pocillo en 100 µl

de medio de cultivo/pozo. Los pocillos exteriores no se utilizaron para el ensayo ya que había

muchas más fluctuaciones de temperatura y, por lo tanto, variaciones de señal en comparación con el interior

pozos En cambio, se llenaron con PBS para crear una masa térmica. Veinticuatro horas

después de la siembra, se eliminó el medio de crecimiento y las células se lavaron con PBS.

Los pocillos por triplicado se trataron durante 1 h con 100 µl de fitoquímicos puros o extractos de pulpa.

en medio de tratamiento que contiene DCFH-DA 25 µM. A continuación, las células se lavaron con 100

µl de PBS. A continuación, se aplicaron 100 µl de HBSS que contenía ABAP 600 µM a cada

Bueno. La placa se colocó inmediatamente en un Synergy HT Multi-precalentado (37ºC).

Lector de microplacas de detección (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) para análisis cinético

medición de fluorescencia. El filtro de emisión utilizado fue de 485 nm, paso de banda de 20 nm y

filtro de excitación de 528 nm, paso de banda de 20 nm. El lector de placas fue controlado por KC4™

versión 3.4 (revisión 10) con un ajuste de sensibilidad de 50. La lectura de fluorescencia fue

tomado cada 5 min durante 1 h. En cada placa, también se colocaron pocillos de control y blanco por triplicado.

incluido. Los pozos de control contenían medio de tratamiento con DCFH-DA y HBSS con

oxidante. Los pocillos en blanco contenían medio de tratamiento con DCFH-DA y HBSS sin

oxidante.
 36

III.10.e. Cuantificación de CAA

Después de restar el blanco de todas las lecturas de fluorescencia, el área neta bajo la curva

se calculó a partir de la curva de fluorescencia frente al tiempo de cada concentración de puro

extractos fitoquímicos y de pulpa, así como pozos de control. El área bajo la curva

(AUC) se calculó utilizando un método trapezoidal, de la siguiente manera:

ABC = (0.5 + f2/F1+ f3/F1+ f4/F1+ f5/F1+ … + fnorte/F1) × CR

donde f1es la intensidad de fluorescencia al inicio de la reacción, fnortees la fluorescencia

señal medida en el último ciclo, y RC es el período del ciclo de lectura de fluorescencia

intensidad medida en minutos.

Luego, la unidad CAA se calculó utilizando la fórmula de la siguiente manera:

Unidad CAA = 100 – [(AUC de muestras ÷ AUC de control) × 100]

Como las unidades CAA de diferentes concentraciones de cada fitoquímico puro o extractos de pulpa

se obtuvieron, se generó la curva dosis-respuesta. La curva de respuesta a la dosis fue

luego se convierte a gráfico de efecto mediano de log (fa/Ftu) versus log (concentración o dosis) para

determinar la dosis efectiva mediana (EC50) de fitoquímicos puros y extractos de pulpa. Faes

la fracción afectada, que es igual a la unidad CAA, y ftues la fracción no afectada,

calculado como: 100 - unidad CAA. CE50, que se determina a partir de la gráfica del efecto de la mediana, es

la concentración necesaria para inducir la reducción a la mitad del AUC en un tiempo de exposición determinado.

En otras palabras, CE50el valor es la concentración a la que fa/fu = 1 (log fa/fu = 0) o CAA

= 50 calculado a partir de la regresión lineal de la gráfica efectiva mediana. CE50valores

se convirtieron a unidades CAA de μmoles de equivalentes de quercetina (QE)/100 g de pulpa, derivados

 37

normalizando la CE50de las muestras de pulpa a la CE50de quercetina como referencia. CE50

se expresaron como media ± error estándar (SE).

III.11. Análisis estadístico

Todos los resultados se presentan como media ± SE. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando

MATLAB 7.9.0.529 (R2009b) (The MathWorks, Inc., Natick, MA). Diferencias entre

medias fueron detectadas por ANOVA, que es seguido por múltiples comparaciones usando

Prueba de diferencia significativa de Tukey. La determinación de las diferencias de fenoles totales

contenido, antes y después de la corrección usando PVPP, se evaluó usando un par de dos colas

Estudiantest-ensayo para cada tratamiento. Los resultados se consideraron significativos cuando elpag

el valor fue <0,05.

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

38

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de los análisis realizados en no pasteurizados, pasteurizados simples y

pulpa de cacao doblemente pasteurizada se presentan y discuten en este capítulo. Cambios de

contenido total de fenoles, valores ORAC y color de la pulpa de cacao después del procesamiento y

durante el almacenamiento fueron evaluados y comparados con el control sin procesar. Diferencias en CAA

También se evaluaron los valores antes y después de la pasteurización.

IV.1. Procesamiento térmico secundario de pulpa de cacao

En este estudio, se realizó un procesamiento térmico secundario de pulpa de cacao para imitar el

escenario de doble procesamiento al que se someten los productos a base de frutas comercializados en el

ajuste de la industria. Esos productos fueron procesados térmicamente por el proveedor, que es

seguido por el procesamiento secundario que conduce a la producción de productos listos para el consumo no perecederos.

productos para comer/beber.Figura IV.1muestra la variación de temperatura y F- calculado

valor con el tiempo del procesamiento térmico secundario, el cual fue adquirido a través de la

sistema de adquisición de datos.

 39

120 10
Tiempo frente a temperatura (°C)
Tiempo frente a valor F
100
8

80
Temperatura (°C)

Valor F (s)
60

4
40

2
20

0 0
0 50 100 150 200 250

Tiempo (s)

Figura IV.1 Variación de temperatura y valor F calculado con el tiempo durante el

tratamiento térmico secundario de la pulpa de cacao.
 40

Como se muestra enFigura IV.1,procesamiento térmico mediante inmersión en agua caliente

experimentó una velocidad de calentamiento lenta. Fue difícil llegar rápidamente a la meta final prevista.

temperatura de 85ºC debido a: 1) baja relación de volumen de agua caliente a muestras dado el tamaño de

La tetera; 2) la ausencia de elemento de mezcla para lograr una transferencia de calor por convección uniforme

desde el vapor en la capa exterior de la tetera hasta el agua circundante; y 3) el grueso

y consistencia pulposa de la pulpa. Además,Figura IV.1también mostró que al final

de este proceso, se obtuvo un valor F de 7 s en lugar de 6 s. Fue debido a la acción manual.

de abrir una válvula para descargar agua caliente y verter la mezcla de hielo y agua para iniciar el

proceso de enfriamiento La velocidad de enfriamiento no contribuyó significativamente al valor F.

IV.2. Contenido total de fenoles de la pulpa de cacao

El contenido de fenoles totales de la pulpa de cacao se determinó mediante Folin-Ciocalteu

ensayo, con ácido gálico como compuesto estándar. El ensayo de Folin-Ciocalteu es un

método espectrofotométrico y, por lo tanto, la absorbancia de varias concentraciones de ácido gálico

fueron medidos y mostrados enFigura IV.2.

 41

1.8

1.6

1.4
Absorbancia a 745 nm

1.2

1.0

0.8

0.6 y= 0.0025x – 0.0094

r2= 0.9998
0.4

0.2

0.0
0 200 400 600

Concentración de ácido gálico (µg/ml)

Figura IV.2 Curva estándar de ácido gálico utilizada en la determinación de fenoles totales
de Folin-Ciocalteu (absorbancia a 745 nm ± SE, n=3).
 42

Como la absorbancia de la pulpa no pasteurizada, simple y doblemente pasteurizada

extractos fueron interpolados en la curva estándar enFigura IV.2, el promedio total

contenido de fenoles antes de la unión de PVPP obtenidos fueron 137,10 ± 4,69, 111,04 ± 0,56, y

97,58 ± 0,37 mg GAE/ 100 g de pulpa para pulpa no pasteurizada, simple y doble pasteurizada,

respectivamente. Sin embargo, el contenido total de fenoles de los productos sin pasteurizar, simples y dobles

pulpa pasteurizada después de la unión de PVPP fueron 103,76 ± 4,79, 77,88 ± 0,65 y 64,21 ± 0,32

mg GAE/ 100 g pulpa, respectivamente. Esto mostró que al unir extractos a PVPP, un

sobreestimación significativa de fenoles totales, debido a compuestos que interfieren, en un 24%,

30% y 34%, para pulpa sin pasteurizar, pasteurizada y doble pasteurizada, respectivamente,

podría evitarse. Valores no corregidos y corregidos del contenido total de fenoles de la pulpa de cacao

Las muestras se resumieron enFigura IV.3. No obstante, la pulpa de cacao sin pasteurizar

(valores corregidos) contenían una cantidad medible de fenoles totales muy similar al verde

uvas, que se informó que tienen un contenido total de fenoles de 145 mg GAE/100 g de uvas

(Wu et al., 2004).

La unión de PVPP es un método diferencial; uno de los métodos más utilizados

para tener en cuenta los compuestos que interfieren, como el ácido ascórbico, los azúcares y las proteínas. ascórbico

El ácido y los azúcares son compuestos de interferencia aditivos ya que reducen Folin-Ciocalteu

reactivo y, por lo tanto, su presencia aumenta el valor de fenoles totales. Por otro lado,

La proteína es un compuesto inhibidor que interfiere ya que puede unirse a compuestos fenólicos.

a través de interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno; por lo tanto, causando el sitio activo de

compuestos fenólicos no disponibles para reducir el reactivo de Folin-Ciocalteu(Singleton et al.,

1999). Sin embargo, los posibles efectos inhibidores de la proteína se ignoraron en este estudio ya que

el contenido de proteína de la pulpa de cacao es muy bajo. Este método de unión de PVPP había sido
 43

adoptado para determinar el contenido total corregido de fenoles de bellotas de roble influenciado por

procesamiento térmico(Rakić et al., 2007).

La adsorción de PVPP a fenoles carece de puntos de corte precisos porque PVPP se une a

diferentes tamaños y tipos de polifenoles. PVPP tiene una mayor afinidad por los más grandes

compuestos fenólicos y no adsorben fácilmente los no taninos como el ácido gálico y (+)-

catequina, a menos que se disponga de suficiente tanino condensado u otros fenoles menos solubles para

entrecruzamiento(Singleton et al., 1999). Otros factores como el área superficial del adsorbente

y nivel de hidroxilación de los compuestos fenólicos como sitios de unión para unir el adsorbente

puede manipularse para aumentar la capacidad de unión de PVPP a compuestos fenólicos; sin embargo

la eliminación completa de fenoles no es posible. Eliminación de aproximadamente 80-90% de

Se observaron flavanoles de cerveza enriquecida con flavanoles por unión de PVPP.(McMurrough

et al., 1995). Debido a la importante presencia de compuestos interferentes detectados por el

método diferencial PVPP en este estudio, sólo los valores corregidos de fenoles totales fueron

utilizado para expresar el contenido total de fenoles a partir de ahora.

Adicionalmente, como se observa enFigura IV.3, pasteurización simple y doble de

la pulpa de cacao condujo, correspondientemente, a una reducción del 25% y 38% de fenoles (pag<0.05)

en comparación con la pulpa no pasteurizada. Esta observación puede deberse al efecto adverso de

calor, otros químicos presentes en la matriz de la pulpa, luz u oxígeno que conduce a la oxidación

y posterior polimerización y degradación de compuestos fenólicos(Nicoli et al.,

1999).
 44

160
a fenólicos totales
140 fenólico total corregido
(mg de equivalentes de ácido gálico/ 100 g de pulpa)

120 b
a*
C
100
fenoles totales

b*
80
C*
60

40

20

0
sin pasteurizar solo pasteurizado doble pasteurizado

pulpa de cacao

Figura IV.3 Contenido total de fenoles de pulpa no pasteurizada y pasteurizada (media ± SE, n=3).
Diferencias estadísticamente significativas (pag<0,05) en los valores medios se
indican con letras diferentes. Arterisks (*) indican diferencia significativa (pag<0.05)
entre el contenido fenólico total y el contenido fenólico total corregido en base al
contenido de Student emparejadot-ensayo en cada tratamiento.
 45

IV.3. Capacidad antioxidante química de la pulpa de cacao

La capacidad antioxidante química de la pulpa de cacao se midió mediante el ensayo ORAC,

con Trolox como compuesto estándar y fluoresceína como sonda de fluorescencia. El

curva de decaimiento de la fluorescencia de la fluoresceína, debido a la oxidación de radicales, dado

diferentes concentraciones de Trolox se muestra enFigura IV.4. Después del AUC de cada decaimiento

curva se calculó utilizando un método trapezoidal, se estableció una curva estándar como se muestra en

Figura IV.5.

160
0 µM
140 6,25 µM
12,5 µM
25 µM
120
Intensidad fluorescente

50 µM
100 µM
100

80

60

40

20

0
0 10 20 30 40

Tiempo (min)

Figura IV.4 Curva de decaimiento de la fluorescencia de Trolox a diferentes concentraciones.

 46

30

25
Área bajo la curva (AUC)

20

15

10 y= 0.2411x + 1.0167
r2= 0.9991
5

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración de Trolox (µM)

Figura IV.5 Curva estándar de Trolox utilizada en el ensayo ORAC (área bajo la curva ± SE,
n=3).
 47

La pulpa de cacao, sin pasteurizar y pasteurizada, contenía una cantidad medible de

actividad antioxidante que se muestra enFigura IV.6. Valores de la capacidad antioxidante del cacao

pulpa se obtuvieron a través de la extrapolación del área bajo la curva de las muestras de pulpa al

curva estándar (Figura IV.5). La capacidad antioxidante de la pulpa sin pasteurizar fue de 1871 ±

58 μmol TE/ 100 g pulpa. Este valor fue comparable con uvas verdes de 1118 ± 96

μmol TE/ 100 g fruta cruda(Wu et al., 2004). La capacidad antioxidante de simples y dobles

pulpa pasteurizada no fueron significativamente diferentes de la pulpa no pasteurizada (pag>0,05). El

Los valores ORAC de pulpa pasteurizada simple y doble fueron 1835 ± 41 μmol TE/ 100 g de pulpa

y 1681 ± 157 μmol TE/ 100 g pulpa, respectivamente.

La estabilidad de los valores de capacidad antioxidante de la pulpa pasteurizada en comparación

a la pulpa sin pasteurizar (Figura IV.6) podría ser debido a la degradación de hidrolizable

taninos, un compuesto polifenólico más grande, que da como resultado la formación de

productos de degradación, como el ácido gálico, que mantiene la actividad antioxidante(Rakic et al.,

2007). Por lo tanto, las pulpas tratadas térmicamente poseían la misma capacidad antioxidante en comparación con

la pulpa sin procesar. También es posible que durante el procesamiento, la mejora de

propiedades antioxidantes se produjeron debido a la liberación de fitoquímicos de la matriz celular,

que ha demostrado ser eficaz para el licopeno en los tomates(Dewanto et al., 2002b). En el

Al mismo tiempo, los productos de reacción de Maillard (MRP), que se pueden formar a través de intensas

tratamiento térmico, también podría contribuir a las propiedades antioxidantes superiores(Nicoli et al.,

1997).
 48

2500
Capacidad Antioxidante (AOC) (µmol

2000 a a a
Trolox Equivalente/100g pulpa)

1500

1000

500

0
sin pasteurizar solo pasteurizado doble pasteurizado

pulpa de cacao

Figura IV.6 Capacidad antioxidante de pulpa sin pasteurizar y pasteurizada (media ± SE, n=3). Las
diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) en los valores medios se indican
con letras diferentes.
 49

IV.4. Color de la pulpa de cacao

El espacio colorimétrico CIELAB, que consta de coordenadas L*, a* y b*, fue

utilizado para caracterizar los cambios de color debido al tratamiento térmico. El color

Las características de la pulpa de cacao se resumen enCuadro IV.1.

Cuadro IV.1 Características de color de la pulpa de cacao (media ± SE, n=3).

pulpa de cacao
Color
características sin pasteurizar Solo pasteurizado Doble pasteurizado

L* 61,17 ± 0,29a 55,86 ± 0,20b 46,68 ± 0,19C

a* 6,25 ± 0,29a 10,09 ± 0,12b 7,97 ± 0,07C

b* 6,71 ± 0,25a 16,12 ± 0,08b 9,99 ± 0,04C

Ángulo de matiz (̊ ) 47,07 ± 0,24a 57,96 ± 0,26b 51,40 ± 0,12b

croma 9,17 ± 0,38a 19,02 ± 0,12b 12,78 ± 0,07C

ΔE* n/A 11,50 ± 6,64a 14,96 ± 8,64a

Diferentes letras en superíndice a través de diferentes tratamientos térmicos indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Se observó una disminución de los valores de L* en los pasteurizados simples y dobles.

pulpa, que puede deberse a reacciones de pardeamiento aceleradas por el procesamiento térmico.

También se reportó una observación similar al calentar el puré de pera entre 80-98ºC a

diferente tiempo de procesamiento(Garza et al., 1999)y zumo de naranja 94,6ºC durante 30 s en tubular

intercambiador de calor(Yeom et al., 2000). Hubo un aumento general de los valores a* y b*

de pulpa procesada térmicamente que indicó una dirección hacia más amarillo y rojo en

pulpa pasteurizada. El ángulo de tonalidad tanto de la pulpa individual como de la pasteurizada fue significativamente

más alto (pag<0,05) que la pulpa sin pasteurizar. Además, los valores de croma más altos de térmicamente

pulpa procesada fueron consistentes con las diferencias visuales percibidas como intensas y oscuras

color crema (RGB: 255, 253, 208). Se sugirió que la severidad de la temperatura
 50

tratamientos afectaron el color de los jugos y purés de frutas a través de la formación de 5-

hidroximetilfurfural (HMF) que estaban presentes en mayor abundancia a mayor

temperatura y mayor duración del procesamiento(Garza et al., 1999).

La diferencia métrica general de color, expresada en ΔE*, no fue significativa

(pag>0.05) entre pulpa pasteurizada simple y doble en comparación con no pasteurizada

pulpa, lo que indicó que solo el primer paso de pasteurización condujo a un color significativo

Cambios en la pulpa de cacao. Basado en la interpretación de la diferencia de color numérica,Francisco

y Claydesdale (1979)indicó que ΔE* de 2 es indicativo de diferencias notables,

mientras que ΔE* de 3 representaría cambios de color inaceptables en muchos productos.

Desafortunadamente, tanto la pulpa pasteurizada simple como la doble tenían ΔE* superior a 3, un signo de

diferencias de color indeseables. Sin embargo, el procesamiento térmico es necesario para extender la

Vida útil de la pulpa de cacao. Por lo tanto, la exploración de procesos no térmicos que conducen a una mejor

la retención del color puede ser beneficiosa.

IV.5. Estudio de estabilidad de pulpa de cacao pasteurizado simple y doble

La influencia del tiempo y la temperatura de almacenamiento en el contenido de fenoles totales

(valores corregidos), los valores ORAC y el color de la pulpa de cacao después de la pasteurización fueron

monitoreada y determinada quincenalmente por un período de 8 semanas. Tanto individuales como dobles

pulpa de cacao pasteurizada se almacenó en la oscuridad bajo 3 condiciones de almacenamiento diferentes, 4ºC,

25ºC y 37ºC.
 51

IV.5.a. Estudio de estabilidad de pulpa única pasteurizada

Los cambios en fenoles totales a lo largo de un estudio de estabilidad de 8 semanas fueron

resumido enCuadro IV.2para pulpa pasteurizada individual. La influencia del almacenamiento.

la temperatura y el tiempo de almacenamiento, así como su interacción, tuvieron una influencia significativa

(p<0,05) sobre los fenoles totales de la pulpa de cacao (Cuadro IV.3).Figura IV.7demostró que hay

hubo diferencias en la estabilidad del contenido de fenoles totales en diferentes condiciones de almacenamiento.

La tasa de degradación de fenoles fue significativamente menor (p<0,05) cuando es soltero

la pulpa pasteurizada se almacenó a 4ºC, seguida de 25ºC y 37ºC. Al final de los ocho

semanas, hubo una disminución del 14%, 26% y 50% en el contenido de fenoles totales en el almacenamiento

temperatura de 4ºC, 25ºC y 37ºC, respectivamente. Además, al comparar el total

valores de fenoles que se tomaron en el mismo período de almacenamiento pero se almacenaron a diferentes

temperatura, los contenidos de fenoles totales de la pulpa pasteurizada simple almacenada a 37ºC fueron

consistente y significativamente (pag<0.05) el más bajo. Esas observaciones fueron consistentes

con el estudio de estabilidad de frutos y bebidas de espino almacenado a 4ºC frente a 23ºC

y 40ºC realizado porChang et al. (2006). Posibles vías de degradación de los fenoles

puede estar relacionado con la oxidación(de Gaulejac et al., 2001), hidrólisis(Yamada et al., 1997),

o isomerización(Wang y Helliwell, 2000), que se sugirieron de anteriores

estudios pero no investigados en el presente estudio. Además, ciertas enzimas pueden ser

siguen activos en los frutos y contribuyen a la degradación de los componentes activos

(Tomás-Barberán y Espín, 2001).

 52

Cuadro IV.2 La estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple en diferentes condiciones
de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 77,88 ± 0,65a a 73,09 ± 0,33b a 77,90 ± 0,54a a 74,30 ± 0,59b a 66,94 ± 1,04C a

25ºC 77,88 ± 0,65a a 68,79 ± 0,09b b 65,95 ± 0,48b b 72,91 ± 0,91C a 57,62 ± 0,91d b

37ºC 77,88 ± 0,65a a 61,13 ± 0,21b C 44,28 ± 0,50C C 50,14 ± 0,39d b 38,97 ± 0,23mi C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.3 ANOVA de dos vías de la estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple.

Fuente Suma cuadrados df Cuadrado medio F Problema>F

Temperatura 3055.83 2 1527.91 1391.15 0

Tiempo 2577.71 4 644.43 586.74 0
Temperatura*tiempo 1228.27 8 153.53 139.79 0
Error 32.95 30 1.1
Total 6894.76 44
 53

120

4°C
25°C
(mg de equivalentes de ácido gálico/ 100 g de pulpa)

100
37°C

80
Fenólicos totales

60

40

20

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.7 La estabilidad de fenoles totales en pulpa pasteurizada simple en diferentes condiciones
de almacenamiento (media ± SE, n=3).
 54

La influencia de la temperatura de almacenamiento y el tiempo de almacenamiento, así como su interacción.

fueron significativos (p<0,05) sobre los valores ORAC de la pulpa de cacao pasteurizada única (Mesa

IV.5). La capacidad antioxidante de la pulpa de cacao pasteurizada única, como se muestra enCifra

IV.8, fue más estable cuando se almacenó a 4ºC. Basado en la similitud de la tendencia de estabilidad

entre el contenido total de fenoles y los valores ORAC de pulpa pasteurizada única, se

posible que la actividad antioxidante fuera mayoritariamente aportada por compuestos fenólicos. 95%, 85%,

y 60% de retención (Cuadro IV.4) se obtuvieron a partir de pulpa única pasteurizada a finales de

el estudio de vida útil para las condiciones de almacenamiento a 4ºC, 25ºC y 37ºC, respectivamente.
 55

Cuadro IV.4 La estabilidad de la actividad antioxidante en una sola pulpa pasteurizada en diferentes
condiciones de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 1835 ± 41a a 1623 ± 52a a, b 1697 ± 70a a 1699 ± 94a a 1738 ± 32a a

2ºC 1835 ± 41a a 1632 ± 21a, b a 1525 ± 22b a, b 1678 ± 58a, b a 1565 ± 89b a

37ºC 1835 ± 41a a 1411 ± 65b b 1302 ± 66antes de Cristo b 1219 ± 63antes de Cristo b 1097 ± 58C b

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.5 ANOVA de dos vías de la estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa única
pasteurizada.

Fuente Suma cuadrados df Cuadrado medio F Problema>F

Temperatura 997701.2 2 498850.6 49.17 0

Tiempo 771577.4 4 192894.3 19.01 0
Temperatura*tiempo 431536.3 8 53942 5,32 0,0003
Error 304357.8 30 10145.3
Total 2505172.6 44
 56

2500

4°C
Capacidad Antioxidante (AOC) (µmol

25°C
37°C
2000
Trolox Equivalente/100g pulpa)

1500

1000

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.8 La estabilidad de la actividad antioxidante en una sola pulpa pasteurizada en diferentes
condiciones de almacenamiento (media ± SE, n=3).
 57

Características de color, L*, a*, b*, de la pulpa de cacao pasteurizada simple, como se resumen

enTabla IV.6., no se vieron afectados por la interacción de la temperatura de almacenamiento y el almacenamiento

tiempo basado en el método estadístico ANOVA de dos vías (p<0,05) seguido de Tukey

prueba de diferencia significativa. Sin embargo, el efecto de las variables individuales de almacenamiento

la temperatura y el tiempo de almacenamiento es importante. Al final del estudio de almacenamiento, los valores L*

fueron estadísticamente diferentes cuando se almacenaron a 4ºC y 25ºC, pero más bajas a 37ºC. El a* y

Los valores de b* permanecieron estables cuando se almacenaron a 4ºC y 25ºC. Sin embargo, hubo un importante

disminución de los valores de a* y aumento de los valores de b* a 37ºC, que correspondieron respectivamente

a una disminución del enrojecimiento y un aumento de la amarillez.

Al final del estudio de almacenamiento, el ángulo de tonalidad de la pulpa pasteurizada simple (Cuadro IV.7)

aumenta cuando se almacena a 4ºC y 25ºC. Por el contrario, a una temperatura de almacenamiento de 37ºC,

ángulo de matiz mostró algunas fluctuaciones, aumentando hasta la semana 6 y luego disminuyendo en

semana 8. Como resultado, el ángulo de tonalidad de la pulpa almacenada a 4ºC y 37ºC no fue significativamente

diferente (p>0,05). Esta observación puede deberse a la mala colocación de algunas bolsas que

colocados planos y apilados entre sí. Por lo tanto, pueden ocurrir variaciones de temperatura dentro de las bolsas.

durante el almacenamiento. Valores de croma de pulpa pasteurizada simple (Cuadro IV.8) permaneció estable

cuando se almacena a 4ºC; sin embargo hubo ligeros incrementos cuando se almacenó a 25ºC y 37ºC.

A lo largo del estudio de almacenamiento, la estabilidad del croma a 25ºC y 37ºC fue muy similar.

El color observado de la pulpa fue más intenso cuando se almacenó a mayor temperatura. Él

Se sugirió que la temperatura elevada permitió y aceleró las reacciones de Maillard para

proceder(Be Miller y Whistler, 1996). Además, las polifenoloxidasas, que tienen

aún no ha sido inactivado, puede causar oscurecimiento en la muestra a través de enzimas

ruta de dorado(Haard y Chism, 1996; Whitaker, 1996).

 58

Cuadro IV.6 La estabilidad de L*, a* y b* en pulpa pasteurizada única en diferentes condiciones

de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8
L*

4ºC 55,86 ± 0,20a a 53,69 ± 0,04b a 53,73 ± 0,11b a, b 53,72 ± 0,13b a, b 54,83 ± 0,05C a

25ºC 55,86 ± 0,20a a 54,72 ± 0,07b b 55,69 ± 0,17a a 55,07 ± 0,04b, a 53,71 ± 0,10C a

37ºC 55,86 ± 0,20a a 53,90 ± 0,05a, b a 52,82 ± 0,86b b 53,42 ± 0,59b b 47,46 ± 0,44C b

a*

4ºC 10,09 ± 0,12a a 10,69 ± 0,05b a 9,66 ± 0,10a a 9,88 ± 0,19a a 9,02 ± 0,07C a

25ºC 10,09 ± 0,12a, b a 10,20 ± 0,04a, b b 9,01 ± 0,57b a 9,46 ± 0,10b a, b 8,52 ± 0,36antes de Cristo a

37ºC 10,09 ± 0,12a a 10,22 ± 0,03a b 9,27 ± 0,19b a 8,94 ± 0,12b b 10,53 ± 0,23a b

b*

4ºC 16,12 ± 0,08a a 14,84 ± 0,05b a 14,42 ± 0,37b a 14,58 ± 0,15b a 16,23 ± 0,07a a

25ºC 16,12 ± 0,08a a 16,88 ± 0,01a, b b 17,83 ± 0,41b b 18,14 ± 0,08b 19,47 ± 0,24C b

37ºC 16,12 ± 0,08a a 18,39 ± 0,02b C 17,95 ± 0,55antes de Cristo b 19,22 ± 0,59antes de Cristo b 17,73 ± 0,26C C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).
 59

Cuadro IV.7 La estabilidad del ángulo de tonalidad ( )̊ en pulpa pasteurizada única en diferentes condiciones de
almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 57,96 ± 0,26a a 54,22 ± 0,03b a 55,76 ± 0,78b a 55,90 ± 0,26b a 60,93 ± 0,12C a

25ºC 57,96 ± 0,26a a 58,86 ± 0,12a b 63,24 ± 0,91b b 62,46 ± 0,27b b 66,37 ± 0,97C b

37ºC 57,96 ± 0,26a a 60,95 ± 0,04a C 62,25 ± 1,07a, b b 65,02 ± 0,95b b 59,28 ± 0,87a a

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.8 La estabilidad del croma en pulpa pasteurizada única en diferentes condiciones de
almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 19,02 ± 0,12a a 18,29 ± 0,06a, b a 17,41 ± 0,32a, b a 17,61 ± 0,23a, b a 18,57 ± 0,09a a

25ºC 19,02 ± 0,12a a 19,73 ± 0,02a b 19,99 ± 0,63a, b b 20,46 ± 0,09,b b 21,26 ± 0,25b b

37ºC 19,02 ± 0,12a a 21,03 ± 0,03b C 20,21 ± 0,40b b 21,21 ± 0,49b b 20,63 ± 0,16b b

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).
 60

Para tener en cuenta los cambios generales en los valores L*, a* y b* de pulpa pasteurizada simple

a lo largo de su estudio de estabilidad, la diferencia de color general (ΔE*) de la pulpa pasteurizada única

se derivó utilizando la ecuación de Hunter-Scotfield (secciónIII.9) y se muestra enFigura IV.9.

La mayor diferencia de color general de 8,5 se observó cuando la pulpa pasteurizada única

se almacenó a 37ºC. Además, al final del estudio de almacenamiento, los cambios generales de color de

Se observaron aproximadamente 4 y 1,5 para muestras que se almacenaron a 25ºC y 4ºC,

respectivamente. Todos los valores de ΔE* de pulpa pasteurizada individual fueron perceptibles visualmente y

indeseable.

14 4ºC
25ºC
37ºC
12
Diferencia de color general

10

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.9Diferencia de color general de pulpa pasteurizada individual durante el estudio de almacenamiento
 61

IV.5.b. Estudio de estabilidad de pulpa doble pasteurizada

El contenido total de fenoles de la pulpa doble pasteurizada no se vio afectado por el almacenamiento

la temperatura, el tiempo de almacenamiento y la interacción entre la temperatura de almacenamiento y la

tiempo (Cuadro IV.10). A 4ºC de temperatura de almacenamiento hubo un aumento significativo (p<0,05)

en el contenido de fenoles totales de la pulpa doble pasteurizada, que se puede observar a partir de

semana dos y se mantuvo estable hasta la semana ocho (Figura IV.10). El leve observado

Sin embargo, el aumento del contenido total de fenoles podría no tener ninguna importancia práctica. En

En comparación, el contenido total de fenoles de la pulpa doble pasteurizada fue muy estable cuando

almacenado a 25ºC. Sin embargo, a una temperatura de almacenamiento de 37ºC, los fenoles totales de doble

pulpa pasteurizada parecía ser la menos estable, como lo demuestra una disminución más pronunciada de

retención de fenoles al final del estudio de almacenamiento en comparación con los almacenados a 4ºC

y 25ºC. el 8elsemana, la retención de fenoles fue solo del 70% en comparación con 99-

100% cuando se almacena a 4ºC y 25ºC (Cuadro IV.9). Estas observaciones estaban de acuerdo

con estudios previos que también reportaron un ligero aumento en el contenido de fenoles en naranja

jugo(Gil-Izquierdo et al., 2002)y la estabilidad del contenido de fenoles en kiwi durante

almacenamiento a temperatura de refrigeración durante 2 meses(Tavarini et al., 2008). Además, por

Al final del estudio de estabilidad, los valores de fenoles totales de la pulpa doble pasteurizada fueron

ligeramente superior en comparación con los de pulpa pasteurizada simple en cada almacenamiento respectivo

temperatura. Esto sugirió que la degradación ocurrió más rápido durante el almacenamiento de un solo

pulpa pasteurizada.
 62

Cuadro IV.9 La estabilidad de fenoles totales en pulpa doble pasteurizada en diferentes condiciones de
almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 63,78 ± 0,32a a 72,21 ± 0,95b a 71,71 ± 0,59b a 72,93 ± 1,23b a 74,17 ± 1,42b a

25ºC 63,78 ± 0,32a a 62,00 ± 1,48a b 64,05 ± 1,00a b 62,54 ± 1,16a b 63,06 ± 1,13a b

37ºC 63,78 ± 0,32a a 58,33 ± 0,21b b 55,20 ± 2,37b C 44,25 ± 0,46C C 44,82 ± 0,68C C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.10 ANOVA de dos vías de la estabilidad de fenoles totales en pulpa doble
pasteurizada.

Fuente Suma cuadrados df Cuadrado medio F Problema>F

Temperatura 2354.9 2 1177.29 341.59 0

Tiempo 142.21 4 35,55 10,32 0
Temperatura*tiempo 947.63 8 118.45 34.37 0
Error 103.39 30 3.45
Total 3547.82 44
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

63

120

4°C
25°C
(mg de equivalentes de ácido gálico/ 100 g de pulpa)

100
37°C

80
Fenólicos totales

60

40

20

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.10La estabilidad de fenoles totales en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenamiento (media ± SE, n=3).
 64

La capacidad antioxidante química de la pulpa doble pasteurizada no fue afectada por

el tiempo de almacenamiento y la interacción entre la temperatura y el período de almacenamiento; sin embargo, el

La influencia de la temperatura de almacenamiento fue significativa (Cuadro IV.12). Basado en el análisis de

la estabilidad de la capacidad antioxidante de la pulpa doble pasteurizada (Figura IV.11), la tendencia

fue muy similar en su contenido de fenoles (Figura IV.10). Capacidad antioxidante del doble

la pulpa pasteurizada se mantuvo estable y fue muy similar entre 4ºC y 25ºC de almacenamiento

condiciones. El resultado estuvo de acuerdo conMiller et al. (1995), en el que la

La actividad antioxidante en el jugo de manzana se mantuvo estable en un estudio de almacenamiento de 10 días en manzana.

jugo a 4ºC ya temperatura ambiente. Almacenamiento a 4ºC, 25ºC y 37ºC respectivamente

condiciones, la retención de los valores ORAC al final del estudio de vida útil fue del 100%,

95% y 77%.
 sesenta y cinco

Cuadro IV.11 La estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa doblemente pasteurizada en diferentes

condiciones de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 1681 ± 157a a 1828 ± 47a a 1917 ± 52a a 1917 ± 120a a 1726 ± 78a a

25ºC 1681 ± 157a a 1764 ± 43a a 1730 ± 34a a, b 1637 ± 49a a 1593 ± 48a a

37ºC 1681 ± 157a a 1591 ± 73abdominales a 1468 ± 59a, b b 1270 ± 27b b 1294 ± 35a, b b

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.12 ANOVA de dos vías de la estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa doble
pasteurizada.

Fuente Suma cuadrados df Cuadrado medio F Problema>F

Temperatura 953144.7 2 476572.4 20.23 0

Tiempo 219151.5 4 54787.6 2,33 0,0792
Temperatura*tiempo 366864.2 8 45858 1,95 0,0893
Error 706853.8 30 23561.8
Total 2246013.1 44
 66

2500

4°C
25°C
Capacidad Antioxidante (AOC) (µmol

37°C
2000
Trolox Equivalente/100g pulpa)

1500

1000

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.11La estabilidad de la actividad antioxidante en pulpa doble pasteurizada a diferentes

condiciones de almacenamiento (media ± SE, n=3).
 67

Las características de color, L*, a*, b*, de la pulpa de cacao doble pasteurizada, fueron

resumido enCuadro IV.13. Estos parámetros no se vieron afectados por la interacción de

temperatura y tiempo de almacenamiento basados en el método estadístico ANOVA de dos vías (p<0,05)

seguido de la prueba de diferencia significativa de Tukey. Sin embargo, el efecto de las variables individuales

de la temperatura y el tiempo de almacenamiento es importante. Valores de luminosidad (L*) de doble

la pulpa pasteurizada disminuyó con el tiempo de almacenamiento. Los valores de L* fueron más altos cuando se almacenaron en

25ºC, que fue ligeramente superior en comparación con las condiciones de almacenamiento de 4ºC y 37ºC. Sin embargo,

al final del estudio de almacenamiento de pulpa doble pasteurizada los valores de ligereza fueron

más alto (p<0,05) que la pulpa pasteurizada simple en el mismo tiempo de almacenamiento. Esto indicó que

podría haber una acción blanqueadora de metales traza, oxígeno yluces (Bohart y

Carson, 1955). valores a* y b* de doble pasteurizado, que fueron muy similares a los de simple

pulpa pasteurizada, también aumentó con el período de almacenamiento en los tres almacenamientos diferentes

temperaturas Esto es consistente con la apariencia visual de la pulpa que mostró una

aumento de la amarillez y el enrojecimiento, respectivamente.

Ángulo de matiz (Cuadro IV.14) también aumentó con el tiempo de almacenamiento con el valor más alto

obtenido cuando se almacena a 4ºC, y seguido de condiciones de almacenamiento de 37ºC y 25ºC. Por el

final del estudio de estabilidad, los valores del ángulo de tonalidad fueron muy similares a los de un solo pasteurizado

pulpa. Como era de esperar, la tendencia de croma (Cuadro IV.15) los valores fueron consistentes con solo

pulpa pasteurizada, más alta cuando la pulpa doble pasteurizada se almacenó a 37ºC, seguida de

Condiciones de almacenamiento 25ºC y 4ºC.

 68

Cuadro IV.13 La estabilidad de L*, a* y b* en pulpa doble pasteurizada en diferentes condiciones

de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

L*

4ºC 46,68 ± 0,19a a 53,06 ± 0,06b a 52,84 ± 0,11antes de Cristo a 52,67 ± 0,09antes de Cristo a 53,46 ± 0,08b a

25ºC 46,68 ± 0,19a a 53,53 ± 0,53b a 54,35 ± 0,18antes de Cristo a 54,70 ± 0,05antes de Cristo b 55,39 ± 0,25C b

37ºC 46,68 ± 0,19a a 54,46 ± 0,19b b 52,16 ± 1,67b a 53,55 ± 0,09b C 53,26 ± 0,15b a

a*

4ºC 7,97 ± 0,07a a 9,51 ± 0,07b a 9,47 ± 0,04b a 9,43 ± 0,05b a 8,97 ± 0,06C a

25ºC 7,97 ± 0,07a a 9,29 ± 0,09b a 8,84 ± 0,14b b 8,64 ± 0,07b b 8,37 ± 0,12a, b b

37ºC 7,97 ± 0,07a a 8,50 ± 0,18a, b b 8,35 ± 0,16a, b b 8,59 ± 0,09b b 8,14 ± 0,03a, b b

b*

4ºC 9,99 ± 0,04a a 14,15 ± 0,10b a 14,16 ± 0,05b a 14,27 ± 0,04b a 14,04 ± 0,08b a

25ºC 9,99 ± 0,04a a 15,51 ± 0,46b b 16,40 ± 0,16antes de Cristo b 17,24 ± 0,14C b 17,65 ± 0,04C b

37ºC 9,99 ± 0,04a a 17,65 ± 0,09b C 18,36 ± 0,12b C 19,46 ± 0,17C C 19,01 ± 0,07C C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).
 69

Cuadro IV.14 La estabilidad del ángulo de tonalidad ( )̊ en pulpa doble pasteurizada en diferentes condiciones
de almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 51,40 ± 0,12a a 56,10 ± 0,07b a 56,22 ± 0,03b a 56,54 ± 0,10b a 57,42 ± 0,17C a

25ºC 51,40 ± 0,12a a 59,05 ± 0,51b b 61,67 ± 0,15C b 63,37 ± 0,23d b 64,62 ± 0,37d b

37ºC 51,40 ± 0,12a a 64,30 ± 0,37b C 65,38 ± 0,32C C 66,18 ± 0,17cd C 66,81 ± 0,15d C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).

Cuadro IV.15 La estabilidad de croma en pulpa doble pasteurizada en diferentes condiciones de

almacenamiento (media ± SE, n=3).

Tiempo (semana)
Almacenamiento

Temperatura
0 2 4 6 8

4ºC 12,78 ± 0,07a a 17,04 ± 0,12b a 17,04 ± 0,06b a 17,10 ± 0,06b a 16,66 ± 0,09C a

25ºC 12,78 ± 0,07a a 18,08 ± 0,44b a 18,63 ± 0,20antes de Cristo b 19,28 ± 0,13C b 19,53 ± 0,02C b

37ºC 12,78 ± 0,07a a 19,59 ± 0,16b b 20,17 ± 0,17antes de Cristo C 21,27 ± 0,18C C 20,68 ± 0,05C C

Diferentes letras en superíndice en la misma temperatura de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05). Letras
de subíndice diferentes en el mismo período de almacenamiento indican una diferencia significativa (pag<0,05).
 70

Diferencia de color general (ΔE*) de pulpa doble pasteurizada durante la estabilidad

estudio se muestra enFigura IV.12. La mayor diferencia de color general se observó en

semana 2 en todas las condiciones de almacenamiento. Después de la semana 2, diferencia de color general a 4ºC de almacenamiento

la condición se mantuvo estable con un valor de ΔE* de 8 al final del estudio de almacenamiento. Sobre el

Por otro lado, los valores de ΔE* de las muestras almacenadas a 25ºC y 37ºC aumentaron a un ritmo similar hasta

semana 8. Al final del estudio de almacenamiento pulpa doble pasteurizada almacenada a 25ºC y 37ºC

tenía valores de ΔE* de aproximadamente 12. Dado que los valores de ΔE* de la pulpa doble pasteurizada

eran mayores de 3, los cambios de color eran visualmente perceptibles e indeseables.

14 4ºC
25ºC
12 37ºC
Diferencia de color general

10

0
0 2 4 6 8

Tiempo (semana)

Figura IV.12Diferencia de color general de la pulpa doble pasteurizada durante el estudio de almacenamiento.
 71

IV.6. Actividad antioxidante celular de la pulpa de cacao

Las actividades antioxidantes celulares de la pulpa de cacao pasteurizada y sin pasteurizar fueron

medido usando CAA. La cinética de generación de fluorescencia en células HepG2 por ABAP

se muestran enFigura IV.13-16. El aumento de la fluorescencia a través de la formación de DCF fue

inhibido por la quercetina (Figura IV.13.AC), sin pasteurizar (Figura IV.14.AC), soltero

pasteurizado (Figura IV.15.AC), y doble pasteurizado (Figura IV.16.AC) pulpa de cacao,

de forma dosis dependiente. Para calcular aún más la CE50de quercetina y pulpa de cacao,

la curva dosis-respuesta (Figura IV.17) y gráficas de efecto mediano (Figura IV.18) eran

trazados para cada muestra, que se derivaron de los datos presentados enFigura IV.13-16.

la CE50valores y dosis medianas de citotoxicidad de quercetina y pulpa de cacao, como

así como los valores CAA de pulpa expresados como µmol de QE/100g de pulpa, se enumeraron enMesa

IV.16. Los valores resumidos fueron triplicados interexperimentales. la CE50de quercetina

estándar fue ligeramente más alto que lo informado previamente porWolfe y Liu (2007), cual

fue 5,92 ± 0,07 µM. Los valores CAA de la pulpa de cacao sin pasteurizar y pasteurizada fueron

expresado como micromoles de QE por 100 g de pulpa para comparar su calidad antioxidante con

quercetina La pulpa doble pasteurizada fue la más efectiva para inhibir el radical peroxilo.

oxidación DCFH inducida, seguida de pulpa única pasteurizada y no pasteurizada,

respectivamente. Sin embargo, la pulpa sin pasteurizar compartió valores CAA similares con la manzana.

(28,1 ± 4,1 µmol de QE/100g) y uva tinta (24,1 ± 1,7 µmol de QE/100g)(Wolfe y Liu,

2007).

La tendencia de la actividad antioxidante celular de la pulpa de cacao indicó que

la pasteurización aumentó los valores de CAA.Bravo (1998)sugirió que la absorción y

 72

el metabolismo de los compuestos fenólicos estuvo influenciado por: 1) el grado de glicosilación/acilación, 2)

estructura básica, 3) conjugación con otros fenoles, 4) tamaño molecular, 5) grado de

polimerización, y 6) solubilidad. Así, considerando la presencia de pectina, celulosa,

hemicelulosa y lignina en la pulpa de cacao, es posible que el calor durante la pasteurización

fenoles liberados de estas matrices insolubles, así como descompuso los más grandes

compuestos polifenólicos hidrolizables, produciendo compuestos más pequeños que exhibieron

mayor respuesta en CAA. Además, la pulpa de cacao puede contener compuestos fenólicos en estado estable.

formas de glucósidos que pueden ser desglicosiladas por calor en agliconas, lo que mejora

su biodisponibilidad.Williamson (2004)propuso que los flavonoides glicosilados deben ser

desglicosilado antes de la absorción como vía de absorción de los flavonoides. Agliconas que

se liberan, se difunden en las células epiteliales del intestino delgado y pueden aumentar

biodisponibilidad de fenoles a través de una mayor solubilidad/coeficientes de partición.

Sin embargo, se necesitan más investigaciones para apoyar las proposiciones anteriores pertinentes

en este estudio.
 73

2500
quercetina 0 µM
quercetina 3 µM
A
quercetina 4 µM
2000
quercetina 5 µM
Quercetina 6 µM
quercetina 8 µM

unidades de fluorescencia
quercetina 10 µM
1500

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500
quercetina 0 µM
quercetina 3 µM B
quercetina 4 µM
2000
quercetina 5 µM
Quercetina 6 µM
quercetina 8 µM
unidades de fluorescencia

quercetina 10 µM
1500

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500
quercetina 0 µM
quercetina 3 µM C
quercetina 4 µM
2000
quercetina 5 µM
Quercetina 6 µM
quercetina 8 µM
unidades de fluorescencia

quercetina 10 µM
1500

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura IV.13Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2 y
la inhibición de la oxidación por quercetina en el ensayo CAA. Los gráficos A, B y C se
generan a partir de experimentos separados (media ± DE, n=3).
 74

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa A
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa

unidades de fluorescencia
1,5 mg/ml pulpa
1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa B
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500

C
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura IV.14 Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2 y la inhibición
de la oxidación por pulpa de cacao no pasteurizada en el ensayo CAA. Los gráficos A, B y C
se generan a partir de experimentos separados (media ± DE, n=3).
 75

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa
A
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa

unidades de fluorescencia
1,5 mg/ml pulpa
1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500

B
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa C
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500 2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura IV.15 Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2 y la inhibición
de la oxidación por pulpa pasteurizada única en el ensayo CAA. Los gráficos A, B y C se
generan a partir de experimentos separados (media ± DE, n=3).
 76

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa
A
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa

unidades de fluorescencia
1,5 mg/ml pulpa
1500
2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500

B
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa
0,2 mg/ml pulpa
2000 0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1,0 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500 2,0 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

2500
0 mg/ml pulpa
0,1 mg/ml pulpa C
0,2 mg/ml pulpa
2000
0,4 mg/ml pulpa
0,8 mg/ml pulpa
1 mg/ml pulpa
unidades de fluorescencia

1,5 mg/ml pulpa

1500 2 mg/ml pulpa
2,5 mg/ml pulpa

1000

500

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura IV.16 Oxidación inducida por radicales peroxilo de DCFH a DCF en células HepG2 y la inhibición
de la oxidación por pulpa doblemente pasteurizada en el ensayo CAA. Los gráficos A, B y C
se generan a partir de experimentos separados (media ± DE, n=3).
 80 80

A B

60 60
y = 49.98ln(x) - 46.62 y = 5.462ln(x) + 18.91
r2= 0,991 r2= 0,956

40 40

unidades CAA

unidades CAA
20 20

0 0
0 2 4 6 8 10 12 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Quercetina (µM) Pulpa de cacao (mg/ml)

80 80

C D
60 y = 4.972ln(x) + 14.65 60 y = 5.744ln(x) + 13.17
r2= 0,970 r2= 0,932

40 40

unidades CAA

unidades CAA
20 20

0 0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Pulpa de cacao (mg/ml) Pulpa de cacao (mg/ml)

Figura IV.17Curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la oxidación de DCFH inducida por radicales peroxilo por quercetina (A) y
extractos de pulpa de cacao: sin pasteurizar (B), solo pasteurizado (C), y doble pasteurizado (D) en el ensayo CAA. Las
curvas que se muestran en cada gráfico son de datos interexperimentales (media ± SE, n=3).
77
 1.0
0.5
A B
0.5
0.0

0.0

- 0.5
- 0.5

- 1.0
- 1.0

Registro (fa/fu)
Registro (fa/fu)
- 1.5
- 1.5

- 2.0 - 2.0

log (fa/fu) = 2,442 * log (conc) - 2,062; r² = 0,993 log (fa/fu) = 0,451 * log (conc) - 0,661; r² = 0,989
- 2.5 - 2.5
- 1.5 - 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 - 1.5 - 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
Log cocentración (mg/ml) Log cocentración (mg/ml)

0.5 0.5
C D
0.0 0.0

- 0.5 - 0.5

- 1.0 - 1.0

Registro (fa/fu)
Registro (fa/fu)

- 1.5 - 1.5

- 2.0 - 2.0

log (fa/fu) = 0,607 * log (conc) - 0,803; r² = 0,896 log (fa/fu) = 0,830 * log (conc) - 0,887; r² = 0,967
- 2.5 - 2.5
- 1.5 - 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 - 1.5 - 1.0 - 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

Log cocentración (mg/ml) Log cocentración (mg/ml)

Figura IV.18Gráficas de efecto mediano para la inhibición de la oxidación de DCFH inducida por radicales peroxilo por quercetina (A) y cacao
extractos de pulpa: sin pasteurizar (B), solo pasteurizado (C), y doble pasteurizado (D) en el ensayo CAA. Las curvas que se
muestran en cada gráfico son de datos interexperimentales (media ± SE, n=3).
78
 79

Cuadro IV.16 Actividad antioxidante celular de quercetina y pulpa de cacao expresada en

CE50y CAA (media ± SE, n=3).

CE50 CAA citotoxicidad

µmol de QE/ 100g pulpa mg/ml

quercetina 7,00 ± 0,23 µM - > 30

sin pasteurizar
30,45 ± 3,56 mg/mla 23,71 ± 3,12a > 50
pulpa

Soltero
21,41 ± 2,89 mg/mlb 34,13 ± 5,31b > 50
pulpa pasteurizada

Doble
12,41 ± 2,26 mg/mlC 59,76 ± 9,26C > 50
pulpa pasteurizada

Diferentes letras en superíndice dentro de una columna indican una diferencia significativa (pag<0,05).
 80

IV.7. Resultados preliminares de análisis de correlación entre química y celular

ensayo antioxidante

La correlación entre ORAC y CAA de pulpa sin pasteurizar y pasteurizada

fueron trazados enFigura IV.19. Hubo una correlación negativa entre ORAC y CAA

valores a pesar de la base subyacente similar de ORAC y CAA. Tanto ORAC como CAA

se basaron en la medición de la capacidad de eliminación de radicales peroxilo de las muestras.

Además, el alto valor del coeficiente de correlación (r), que posteriormente

contribuyó al alto coeficiente de determinación (r2) valor, no se puede utilizar como un verdadero

medida de la fuerza de la correlación ya que sólo se utilizaron tres puntos de datos.

Se necesitan puntos de datos adicionales para confirmar la fuerza y la dirección de este

análisis de correlación preliminar. Este análisis preliminar de correlación estuvo de acuerdo

con estudios realizados porWolfe et al. (2008)en 25 frutas comúnmente consumidas en Estados Unidos

Estados yEberhardt et al. (2005)en brócoli. Ambos estudios encontraron una débil

correlación negativa entre ORAC y CAA. En definitiva, antioxidante celular

la medición puede proporcionar información que es más relevante para las condiciones fisiológicas

en comparación con el ensayo químico de antioxidantes. Sin embargo, se necesitan más pruebas para

confirmar la relación entre los valores CAA de la pulpa de cacao y su modulación a

tensiones de oxidaciónen vivo.

 81

80

60
(µmol QE/ 100 g)
AAC (EC50)

40 y = -0.182x + 367.4
r2= 0,989

20

0
0 500 1000 1500 2000 2500

ORAC (µmol TE/ 100 g)

Figura IV.19Correlación entre ORAC y CAA de extractos de pulpa de cacao.

 82

v CONCLUSIONES

Las conclusiones del estudio se resumen a continuación:

- El contenido total de fenoles de la pulpa de cacao cuantificado con Folin-Ciocalteu

el ensayo fue de 103,76 ± 4,79 mg GAE/100 g de pulpa. Este valor fue muy similar al

fenoles totales informados de las uvas verdes, que contienen un total relativamente bajo

contenido de fenólicos. Por lo tanto, la pulpa de cacao no es una gran fuente de fenoles.

Además, la estabilidad de los compuestos fenólicos en la pulpa de cacao se vio afectada negativamente por

pasteurización. La pasteurización simple y doble redujo el contenido de fenoles totales

en un 25% y 38%, respectivamente. Por lo tanto, la pulpa de cacao contenía lábil al calor

compuestos fenólicos.

- El valor ORAC de la pulpa de cacao sin pasteurizar fue de 1871 ± 58 μmol TE/ 100 g

pulpa, que también fue similar a los valores ORAC informados de las uvas verdes.

Los valores ORAC, como medida de la actividad antioxidante química de la pulpa de cacao, fueron

no se ve afectado por la pasteurización. Los valores ORAC de pasteurizados simples y dobles

pulpa fueron 1835 ± 41 μmol TE/ 100 g de pulpa y 1681 ± 157 μmol TE/ 100 g de pulpa,

respectivamente. Estos valores no fueron estadísticamente diferentes (p>0,05) si se compara con

pulpa sin pasteurizar. El tratamiento térmico podría liberar compuestos fenólicos que poseían

actividad antioxidante de las matrices celulares o induce la polimerización de fenoles, que

mantuvo los valores ORAC después de la pasteurización.

 83

- La actividad antioxidante celular de la pulpa de cacao sin pasteurizar (EC50) fue 23,71 ±

3,12 µmol de QE/100g de pulpa. Este valor es muy similar al CAA reportado

valores de manzanas y uvas rojas. Antioxidante celular mejorado por pasteurización

actividad de la pulpa de cacao. La pasteurización simple y doble aumentó significativamente

(p<0,05) valores CAA en un 44% y 152%, respectivamente. Pasteurización aumentada

el conjunto de compuestos antioxidantes bioaccesibles, que posteriormente condujo a su

aumento de la absorción celular, liberando fitoquímicos de las matrices celulares o induciendo

polimerización de fenoles.

- Hubo una correlación negativa entre los valores ORAC y CAA en la cuantificación

la actividad antioxidante de la pulpa de cacao. La diferencia de tendencia entre productos químicos y

la actividad antioxidante celular ocurrió ya que el ensayo ORAC descuidó la absorción y

Metabolismo de los compuestos fenólicos. Investigación exahustivaen vivose necesita para

comprender mejor la relevancia de la actividad antioxidante química y celular en

condiciones fisiológicas.

- Diferencias generales de color (ΔE*) de pulpa pasteurizada simple y doble, en relación con

pulpa sin pasteurizar, fueron 11,50 ± 6,64 y 14,96 ± 8,64, respectivamente.

La pasteurización había inducido diferencias visuales de color indeseables posiblemente a través de

Reacciones de pardeamiento de Maillard desde el oscurecimiento de pasteurizados simples y dobles

se percibía la pulpa.
 84

- A lo largo de un estudio de almacenamiento de ocho semanas, pulpas pasteurizadas simples y dobles

mostró muy pocos cambios en los valores fenólicos y ORAC cuando se almacenó a 4ºC y

25ºC. Sin embargo, a una temperatura de almacenamiento de 37ºC, hasta un 50% de pérdida relativa de fenoles

y se observó una pérdida relativa del 40% en los valores de ORAC en pulpa pasteurizada individual;

mientras que la doble pasteurización resultó en una menor pérdida relativa. era probable que

una sola pasteurización no inactivó por completo las enzimas inherentes o

microorganismos que producen enzimas, que son capaces de oxidar fenoles

compuestos. Por lo tanto, la actividad de las enzimas junto con un mayor almacenamiento

temperatura aumentó la tasa de degradación de fenoles en el estudio de estabilidad de

pulpa pasteurizada simple en comparación con pulpa pasteurizada doble.

- Tanto la pulpa pasteurizada simple como la doble mostraron el color general más alto

diferencias (ΔE*) valores cuando se almacena a 37ºC en comparación con 4ºC y 25ºC

temperatura de almacenamiento. Una temperatura de almacenamiento más alta era más propicia para posibles

Las reacciones de pardeamiento de Maillard deben proceder progresivamente.

 85

VI. TRABAJO FUTURO

Con base en los resultados obtenidos en el estudio, futuras investigaciones, como se sugiere

a continuación, será necesario para complementar este estudio:

- Identificación de compuestos fenólicos biológicamente activos, tanto libres como ligados, en

pulpa de cacao

- Desarrollo de parámetros de proceso que optimicen perfiles de seguridad y nutracéuticos

de pulpa de cacao.

- Procesamiento no térmico de pulpa de cacao que puede aumentar la retención de

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