UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
SEGUNDO AÑO DE LA CARRERA MÉDICO CIRUJANO
MICROBIOLOGÍA LABORATORIO. MÓDULO APARATO RESPIRATORIO
Dr. Mario Ávila Aguilar
PRÁCTICA: Mycobacterium Tuberculosis
GRUPO 1309
Equipo: 3 FECHA: 21/03/2022
NOMBRE de alumnos:
● Ayala González Brandon
● Ayala Muños Sherlin Del Carmen
● Bautista Velez Diana Laura
● Chavarría Chávez Carolina Lizbeth
● Daza Rosas Josué Agustín
● Hernandez Delgado Leslye Monserrat
● Meza Cruz Sugey Natali
● Ramírez Lara Fanny Guadalupe
● Rivera Benítez Alejandra
● Saucedo Villalobos Aylin Ayme
FOLIO DE LA PRÁCTICA: 20220314C78577
OBJETIVOS
● Identificar las características morfológicas y bioquímicas de mycobacterium
tuberculosis observada
● Analizar las vías de transmisión y su problema biológico en las vías aéreas
superiores.
● Conocer las formas de identificación y diagnóstico de Mycobacterium
tuberculosis
INTRODUCCIÓN
La tuberculosis (TB) es una de las enfermedades infecciosas con mayor número de
casos responsabilidad de un único agente. Junto con la malaria y la infección por el
VIH, está considerada una prioridad por la OMS.
La distribución de casos de TB no es homogénea en todo el mundo, con incidencia
mayor en los países de baja renta, indirectamente proporcional al desarrollo
económico. Por este motivo, más del 80% de los casos se concentran en 20 países,
como China, India, Pakistán, la Federación Rusa y Sudáfrica, entre otros. En Estados
Unidos y Europa Occidental la mayoría corresponden a pacientes inmigrantes de
lugares con elevada incidencia.
La TB se transmite por vía aérea y la fuente son pacientes con TB pulmonar. Tras la
exposición y contagio ocurre una respuesta local de la inmunidad celular, que resulta
en la formación de granulomas, en cuyo interior un número limitado de bacterias se
mantienen latentes, en más del 90% de casos de forma indefinida. Esta situación se
conoce como infección tuberculosa o tuberculosis latente (TBL).
El diagnóstico precoz y el control del tratamiento son 2 de los factores más importantes
para disminuir la incidencia de TB.
Mycobacterium tuberculosis fue descubierto por Robert Koch en 1882. Pertenece al
género Mycobacterium, que agrupa a más de 120 especies, la mayoría de ellas
ambientales y no patógenas, y a las que se conoce como micobacterias no
tuberculosas (MNT). M.tuberculosis está integrado en el complejo M.tuberculosis
(MTC), con otras 5 especies: M.bovis, M.africanum, M.caprae, M.microti y M.canetti. M.
tuberculosis es, con mucho, la más frecuente. M.bovis BCG es una variedad de
M.bovis que en 1921 dio lugar a la vacuna BCG (bacilo de Calmette y Guerin), aún
utilizada en algunos países.
M.tuberculosis es un bacilo grampositivo, aerobio, con preferencia por tejidos bien
oxigenados. Es un patógeno intracelular obligado y desencadena respuesta de la
inmunidad celular. Aunque también afecta a animales domésticos o salvajes, los
humanos son el hospedador preferente. Se divide lentamente, cada 18-20h, en
comparación a los 20 min de la mayoría de bacterias. La pared celular es rica en
lípidos, con una capa característica de ácidos micólicos, que le confiere ácido-alcohol
resistencia en las tinciones.
En la obtención de las muestras, estas deben ser representativas de la localización. En
las formas pulmonares son las secreciones respiratorias. La más habitual es el esputo.
Para obtener el máximo rendimiento ha de ser de buena calidad. Los pacientes deben
ser instruidos en la producción de secreciones profundas, con predominio de neutrófilos
y sin saliva. En pacientes que no expectoran, el aspirado gástrico o el esputo inducido
pueden ser alternativas, como sucede en menores de 12 años. Las muestras por
broncoscopio están indicadas cuando las anteriores no son posibles o cuando está
indicado diagnosticar otras causas infecciosas. Un volumen de 3-10 ml es adecuado
para la mayoría de muestras respiratorias.
Las muestras deben obtenerse en recipientes estériles, adecuados al volumen y sin
aditivos. Muestras sólidas como biopsias y tejidos deben mantenerse húmedas con
agua destilada estéril. Es importante evitar introducir las muestras en formol, que
inactiva totalmente la viabilidad de los microorganismos. Por este motivo es
aconsejable usar recipientes separados para las muestras destinadas a estudio
microbiológico y anatomopatológico. También es de suma importancia que el volumen
sea adecuado, sobre todo en las muestras obtenidas de forma traumática y difícilmente
repetibles. Un diagnóstico diferencial adecuado priorizará las pruebas.
El diagnóstico de la TB se establece a partir de signos y síntomas clínicos de
sospecha, pruebas de imagen y confirmación microbiológica. El diagnóstico
microbiológico se basa en la utilización de la microscopía y el cultivo. En los últimos
años se han incorporado técnicas de amplificación genética.
Es la demostración de MTC por técnicas de tinción específica. La composición lipídica
de la pared micobacteriana le permite retener los colorantes de tinción, resistiendo la
acción de decolorantes como la combinación de un ácido (sulfúrico o nítrico) con
alcohol. La resistencia ácido-alcohol resistencia diferencia específicamente a las
micobacterias (bacilos ácido-alcohol resistentes [BAAR]) del resto de bacterias. La
tinción más utilizada es la descrita por Ziehl y Neelsen, que tiñe las micobacterias de
rojo sobre fondo azul, en contraposición a las demás bacterias, que se tiñen de azul.
La microscopía o baciloscopia es la prueba más rápida, posible en menos de 2h, y la
más económica. En muchos países de baja renta es la única prueba diagnóstica. Su
principal limitación es la sensibilidad. Requiere en la muestra 5.000-10.000 bacterias/ml
para ser positiva. La sensibilidad está relacionada con la carga bacteriana en las
lesiones. El retraso diagnóstico y la evolución de la enfermedad influyen sobre la carga
bacteriana. Por este motivo, la sensibilidad de la tinción en países de incidencia
elevada es mayor.
La tinción también evalúa la contagiosidad del paciente, y es uno de los criterios
utilizados para cesar el aislamiento de los pacientes, estén o no ingresados. El riesgo
de transmisión es muy reducido cuando la tinción se ha negativizado o después de 2-3
semanas de tratamiento efectivo aunque persista positiva, con excepción de que se
sospeche resistencia a fármacos del tratamiento. No obstante, este es un aspecto
controvertido sobre el que no hay un acuerdo total.
El cultivo es la prueba diagnóstica más sensible y la considerada de referencia. El
dintel de positividad está en 100-1.000 bacterias/ml, de 50-100 veces más sensible que
la microscopía. Debido al crecimiento lento de las micobacterias, las muestras deben
someterse a un proceso previo de eliminación de la flora bacteriana acompañante,
conocido como descontaminación. El cultivo es positivo en alrededor del 85-90% de las
TB pulmonares. En localizaciones extrapulmonares el rendimiento es más bajo,
raramente superior al 50%, exceptuando la localización linfática o en órganos sólidos,
similares a la pulmonar.
Una limitación importante del cultivo es la lentitud del resultado, que puede requerir
varias semanas. Las muestras en las que la tinción ha sido positiva suelen crecer en 3-
12 días, mientras que en las tinciones negativas puede tardar 15-30 días. Los cultivos
líquidos suelen positivizarse antes, en la franja inferior de estos intervalos.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA PRÁCTICA
En esta práctica se realizarán dos procedimientos:
1. Realizaremos el cultivo de la cepa en el agar yema de huevo, para la formación
de las colonias.
2. Posteriormente realizaremos la tinción de Ziehl Neelsen. Esto con el fin de
observar la tonalidad rojiza de los bacilos de la cepa. En nuestro caso, la tinción
no se pudo realizar por motivos de itinerario.
Ambos procedimientos se utilizan para observar mejor la estructura de este
microorganismo.
MATERIAL
● Mechero de bunsen
● Microscopio
● Asa bacteriológica
● Portaobjetos
● Aceite de inmersión
● Alcohol ácido al 39%
● Fucsina de Ziehl
● Azul de metileno
● 1 Tubo con Mycobacterium sp.
● 1 Tubo con medio de cultivo Lowenstein Jensen
● 1 Caja con Agar glicerol telurito
● Peróxido de Hidrógeno
MÉTODOS
1.- Tomar una asada de la cepa y sembrar en los medios de cultivo.
2.- Incubar a 37° C durante 4 días.
3.- Hacer una tinción de Mycobacterium sp. con técnica de Ziehl Neelsen.
4.- Realizar la prueba de la catalasa para Mycobacterium sp.
5.- Reportar los hallazgos microscópicos.
6.- Reportar la morfología colonial del crecimiento en los medios de cultivo.
RESULTADOS ESPERADOS
Crecimiento de la Mycobacterium spp en el medio Lowestein-Jensen (yema de huevo)
No se realizó la tinción.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Como se esperaba se logró observar un extenso crecimiento de colonias en
mycobacterium spp en el cultivo de yema de huevo (Lowestein-Jensen) se logra
apreciar con una tonalidad beige-amarrillo, aparentando que son "migajas de pan"
características de este Mycobacterium spp cuando son extendidas a lo largo del tubo.
CONCLUSIONES
Debido a cuestiones de tiempo no se realizó la tinción de Ziehl Neelsen sin embargo, en el
cultivo de Mycobacterium Spp se obtuvieron los resultados que se esperaban, a pesar de que
no se sembró la cepa de Mycobacterium tuberculosis por el riesgo que esto significaba para
nosotros, las características morfológicas son muy parecidas.
Los resultados se observaron 4 días después del cultivo ya que su crecimiento es más rápido.
Mycobacterium Spp. causa enfermedad pulmonar parecida a la tuberculosis que puede
asociarse con M. kansasii y M. avium–intracellulare; la linfoadenitis puede asociarse con M.
scrofulaceum y el complejo de M. avium; las úlceras en la piel e infecciones en heridas de tejido
blando se asocian con M. fortuitum, M.chelonae, M. ulcerans y M. marinum.
CUESTIONARIO
1.- Describa las características morfológicas del género Mycobacterium complejo
tuberculosis.
Si bien las micobacterias en general pueden variar mucho en su morfología, desde formas
cocoides pequeñas a largos filamentos, M. tuberculosis suele tener una morfología
característica, bacilo delgado de forma recta o ligeramente curvada en frotis teñidos, y su
tamaño suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5 micras de ancho. Ocasionalmente, forma
ramificaciones verdaderas que se observan en cultivos enriquecidos y en frotis de ganglios
linfáticos caseosos. Son bacilos ácido-alcohol resistentes por lo que la tinción de Ziehl-Neelsen
es útil para la coloración de estos microorganismos obtenidos de muestras clínicas o de cultivo.
Con esta tinción, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos
tuberculosos son difíciles de teñir con la tinción de Gram, y se observan como bacilos gram
positivos con tinción irregular. Son bacilos no formadores de esporas, sin flagelos ni cápsula.
2.- Mencione dos medios de cultivo así como su contenido, para el aislamiento del
género Mycobacterium complejo tuberculosis.
Comúnmente usados son los que utilizan como base huevo coagulado, como el
Löwenstein-Jensen y el de Coletsos. Este último facilita el crecimiento de M. bovis y de
cepas disgónicas de M. tuberculosis. También se puede utilizar medios con base de agar
(Middlebrook 7H10, 7H11). Una ventaja de estos medios es que permiten apreciar la
morfología colonial, por lo que se puede observar características de la colonia (rugosidad,
pigmentación, etc.) que son ya datos orientativos para su posterior identificación. En el
medio de Löwenstein-Jensen las colonias de M. tuberculosis empiezan a observarse a las
2-3 semanas de incubación. La mayor desventaja de estos medios es la lentitud de
crecimiento de las micobacterias
3.- Describa una técnica para la toma de la muestra bronquial.
a. Esputos
La toma correcta del esputo es fundamental. Es aconsejable que el paciente se enjuague la
boca previamente con solución salina o agua. El esputo procederá de una expectoración
profunda preferentemente matinal por lo cual hay que instruir al paciente para que no expectore
saliva o descarga postnasal dentro del contenedor. Si no se produce expectoración espontánea
puede inducir el esputo con nebulizaciones de suero salino fisiológico estéril. Se aconseja que
las muestras de esputo sean siempre examinadas por personal capacitado antes de enviar al
laboratorio, para comprobar que no es sólo saliva.
Para esto pueden seguirse estos pasos:
1) Lave su boca con agua limpia para eliminar alimentos y otras partículas
2) Inhale profundamente 2 o 3 veces y exhale fuertemente cada vez
3) Tosa profundamente para producir el esputo
4) Coloque el recipiente de la muestra cerca a su boca para recolectar la muestra, evite la
contaminación fuera del recipiente.
5) Posterior a la toma de muestra, lave sus manos
b. Aspirado traqueal
Se realiza a través del tubo endotraqueal o traqueotomía. Es una muestra, en general de poca
utilidad diagnóstica.
c. Aspirado bronquial
Se recogen secreciones bronquiales, pudiendo introducirse de 3 a 5 ml. de solución salina
estéril.
4.- Describa la técnica de tinción de Ziehl Neelsen.
1.-Preparar un frotis con la muestra (material orgánico con Mycobacterias).
2.- Cubrir el frotis con fucsina fenicada.
3.- Calentar hasta emisión de vapores durante 5 minutos (el exceso de calor destruye a los
microorganismos). Colocar el portaobjetos sobre la malla de alambre moviendo el mechero
de Bunsen acercando o alejando la flama, según requiera calor para emisión de vapores.
Puede también calentarse el frotis, colocando un vaso de precipitado con agua (que hierve)
sobre la malla de alambre y sobre el vaso el frotis.
4.- Lavar con agua corriente para eliminar el exceso de colorante.
5.- Decolorar con alcohol ácido, hasta que las capas finas de colorante adherido al
portaobjetos se vuelvan casi incoloras, 30 segundos aproximadamente.
6.- Lavar con agua corriente para eliminar y neutralizar la acción del alcohol ácido.
7.- Agregar Azul de metileno por un periodo de 30 segundos. 8.- Lavar
con agua.
9.- Secar al aire a temperatura ambiente o con calor suave en la flama del mechero de
Bunsen.
5.- Describa el fundamento de las tinciones fluorescentes
El fundamento de la técnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en fijarse a los anticuerpos mediante un
enlace químico estable que no puede romperse durante el curso de la reacción inmunológica.
Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales, como algunas vitaminas,
esteroides, porfirinas, etc. Otros compuestos que fluorescen –rodamina, auramina,
fluoresceína, colorantes de acridina– se utilizan en distintas técnicas de tinción, como la tinción
de microorganismos ácido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo.
REFERENCIAS
● Procedimientos en Microbiología Clínica [Internet]. www.seimc.org. [citado el 20 de
marzo de 2022]. Disponible en:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/
seimc-procedimientomicrobiologia9.pdf
● INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR [Internet]. Sampac.es. 2012
[citado el 20 de marzo de 2022]. Disponible en:
https://www.sampac.es/images/site/documentacion/protocolos/TRACTO_RESPIRATOR
IO_INFERIOR.pdf
● Módulo 3: Toma y transporte de muestras de esputo [Internet]. OPS.org. [citado el 20 de
marzo de 2022]. Disponible en: https://www.paho.org/en/file/45324/download?
token=dpVgse6D
● Franco Cardoza, Yuliet, Reseña de "LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y SU
APLICACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS". Fitosanidad
[Internet]. 2005;9(3):65-68. Recuperado de: https://www.redalyc.org/articulo.oa?
id=209116189013
● González J. Microbiología de la tuberculosis [Internet] ELSEVIER. Vol 15. Num1. 2014
[citado 21 marzo 2022] Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-seminarios-
fundacion-espanola-reumatologia-274-articulo-microbiologia-tuberculosis-
S1577356614000025
