Este documento describe un experimento para cuantificar la degradación alcohólica de la glucosa a etanol y acetaldehído por la levadura Saccharomyces cerevisiae. El experimento involucra la incubación de la levadura con glucosa y la identificación y cuantificación posterior de los productos de la fermentación, acetaldehído y etanol, mediante métodos colorimétricos. El documento también presenta información teórica sobre la fermentación alcohólica y sus etapas enzimáticas.
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Este documento describe un experimento para cuantificar la degradación alcohólica de la glucosa a etanol y acetaldehído por la levadura Saccharomyces cerevisiae. El experimento involucra la incubación de la levadura con glucosa y la identificación y cuantificación posterior de los productos de la fermentación, acetaldehído y etanol, mediante métodos colorimétricos. El documento también presenta información teórica sobre la fermentación alcohólica y sus etapas enzimáticas.
Este documento describe un experimento para cuantificar la degradación alcohólica de la glucosa a etanol y acetaldehído por la levadura Saccharomyces cerevisiae. El experimento involucra la incubación de la levadura con glucosa y la identificación y cuantificación posterior de los productos de la fermentación, acetaldehído y etanol, mediante métodos colorimétricos. El documento también presenta información teórica sobre la fermentación alcohólica y sus etapas enzimáticas.
Este documento describe un experimento para cuantificar la degradación alcohólica de la glucosa a etanol y acetaldehído por la levadura Saccharomyces cerevisiae. El experimento involucra la incubación de la levadura con glucosa y la identificación y cuantificación posterior de los productos de la fermentación, acetaldehído y etanol, mediante métodos colorimétricos. El documento también presenta información teórica sobre la fermentación alcohólica y sus etapas enzimáticas.
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PRACTICA # 8
DEGRADACIÓN ALCOHÓLICA DE LA GLUCOSA
I. OBJETIVOS a) Formación de acetaldehído y etanol a partir de glucosa en presencia de Saccharomyces cerevisae. b) Cuantificación del etanol
II. MARCO TEÓRICO
Introducción. Las fermentaciones son procesos anaerobios que liberan energía para la formación de ATP en un proceso conocido como “fosforilacion a nivel de sustrato”. La energía producida en los procesos de fermentación y que las células aprovechan para las reacciones edergonicas, se acumulan en forma de ATP; parte de la cual se emplea en la forforilacion de hexosas. La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico que por acción de las levaduras, 1 mol de glucosa es convertida anaeróbicamente en 2 moles de etanol. Las células de levadura son esenciales para producir las enzimas necesarias que participan en el proceso fermentativo, pero una vez que estén presentes ya no serán tan indispensables para que la fermentación se produzca en forma normal. En levaduras, la glucosa anaeróbicamente es convertida en etanol y dióxido de carbono, y las etapas enzimáticas son idénticas a las de la fermentación láctica o glicolisis, a excepción por dos etapas enzimáticas adicionales, donde intervienen la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. La reacción de descarboxilacion del piruvato, en acetaldehído y dióxido de carbono, es catalizada por la piruvato descarboxilasa, enzima que requiere de pirofosfato tiamina (PPT) como coenzima, además de iones Mg2+. Como producto intermedio se forma “acido pirúvico activo” que por liberación de CO2 se convierte en “acetaldehído activo (PPT-Acetaldehido), intermediario que luego se descompone en PPT acetaldehído, este último se reducirá a etanol en la reacción siguiente: no obstante, una parte del acetaldehído activo se condensa a acetaldehído libre para formar aceta- metil-carbonil (acetoina).
Extraído de : http://campus.fca.uncu.edu.ar/ La conversión de acetaldehído en etanol es llevada a cabo por la alcohol deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH + H+ y que cataliza la reacción de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en in medio ligeramente acido (pH de 5 a 6), por el contrario ligeramente alcalino (pH 8 ) esta se realiza de derecha a izquierda. Como inductores de la fermentación alcohólica, no solo actúan las lavaduras de Saccharomyces cerevisae, sino también las bacterias: pseudomonas, xantomonas y aeromonas. En la fermentación alcohólica, además de etanol y dióxido de carbono se origina productos secundarios como glicerina, ácido acético y acido succínico.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Experimento 1 Fermentación de la glucosa por Saccharomyces cerevisae hasta acetaldehído y etanol
En 2 matraces (M1 y M2) de 50ml c/u, agregar lo siguiente:
M1 M2
Levadura de panificación fresca 1.0 g 1.0 g
Sol. de glucosa al 5%, recién preparada a pH 10.00 ml -----
5.5
Sol. de glucosa al 5%, recién preparada a pH ----- 10.00 ml
(.0
Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de ----- 500 mg
calcio
Mezclar y agregar rápidamente parafina liquida 5.0 ml 5.0 ml
hasta que cubra la superficie
Incubar en baño de agua a 37° C durante 60 minutos
Centrifugar a 3,000 rpm
Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones de
acetaldehído y etanol
Identificación del acetaldehído
En el sobrenadante de la muestra de incubación el sulfito de calcio atrapa al acetaldehído, el cual puede observarse por el color azul que se produce al reaccionar con el nitroprusiato de sodio y la piperidina.
Procedimiento En 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, agregar lo siguiente:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Sobrenadante M1 1.0 ml ---- ----
Sobrenadante ;2 ---- 1.0 ml ----
Agua destilada ---- ---- 1.0 ml
Sol. de nitroprusiato de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar y colocar los tubos en baño de agua hirviente por 5 minutos
Observar y anotar el color y olor característico de acetaldehido
Cuantificación del etanol (método de Sheftel modificado)
Fundamento La mezcla oxidante dicromato – ácido sulfúrico actúa sobre el alcohol etílico transformándolo en ácido acético, a la vez que se forma sulfato cromoso con una coloración que varía de amarillo al verde, en forma proporcional a la concentración de etanol existente en la muestra, suceptible a ser medido por fotocolorimetría.
Reactivos: Dicromato de potasio 8.524 g Agua destilada 1000 ml Ácido sulfúrico 1000 ml Mezcla sulfocromica: Verter lentamente el ácido sulfúrico a la solución de bicromato (Reacción exotérmica)
Procedimiento 1. Colocar 0.5 ml de mezcla sulfocromica en un frasco de 30 ml aproximadamente, 2. Colocar exactamente 0.2 ml de la muestra a analizar en una tira doblada de papel filtro adherida a un tapón de jebe con un alfiler. 3. Finalmente colocar herméticamente en el frasco que contiene la solución sulfocromica, cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del frasco ni el reactivo. 4. Colocar las tapas roscas y llevarlos a baño María hirviendo o a estufa a 100 °C por 10 minutos. 5. Retirar el tapón con la tira de papel que contiene a la muestra. Enfriar y agregar 12.5 ml de agua destilada. 6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578nm. 7. Preparar sistemas estándar del mismo modo que para las muestras problema, solo que en su lugar de medir 0.2 ml del estándar respectivo (0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml y 2.0 mg/ml) en la tira de papel filtro. 8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de la misma manera que para la muestra problema, solo que en lugar de esta última medir 0.2 ml de agua destilada en la tira de papel filtro. Resultados
Calcular los factores de calibración respectiva en base a los datos indicados:
Absorbancia Absorbancia Factor de Fc.
(D.O) Neta calibración Promedio
Blanco 0.001
Estándar 1 (0.5 0.005
mg/ml)
Estándar 2 (1.0 0.009
mg/ml)
Estándar 3 (2.0 0.018
mg/ml)
Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (Fermentación de la glucosa),
en el siguiente cuadro:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Identificación del acetaldehído
Coloración obtenida
Cantidad de Etanol (mg %)
IV. CUESTIONARIO 1. Comente o explique los resultados obtenidos en la identificación del acetaldehído. 2. Comente o explique os resultados obtenidos en la cuantificación de etanol del experimento 1 3. Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentación alcohólica de la fructuosa.
4. Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato
descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa
5. Indique para que se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la
presente práctica: Sulfito de Calcio, solución sulfocromica.
6. Mencione las diferencias entre la fermentación láctica y fermentación
alcohólica
7. De que otras maneras se puede estudiar la fermentación alcohólica
8. Que otros compuestos se pueden formar durante la fermentación
