Informe de Laboratorio Extracción de Ácidos Nucleicos y Electroforesis

Juan Camilo Arenas Martínez

Jaime Camaño Sampayo

Luisa María Rua Usma

Melissa Rua Zapata

Bioquímica Médica ll (BMO42-5)

Instituto Tecnológico Metropolitano (ITM)

Medellín

2020
 INFORME LABORATORIO EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

OBJETIVOS

 Comprender el fundamento de los métodos de purificación de ácidos nucleicos

mediante el método de columna.

6.1 Describir que acción tiene cada uno de los componentes del Buffer de Digestión durante

la fase de homogenización.

Para la liberación de los componentes internos de la célula, se hace a través de un Buffer de

Lisis, el cual, dentro de este se encuentra: Un detergente, un agente (Tris HCl), y un Quelante

(EDTA).

El detergente, quien se encarga del rompimiento de la membrana para que así se liberen

todos los componentes de la célula, luego, este se combina con un agente (Tris HCl), encargado

de amortiguar y estabilizar el PH; Dentro del Buffer, también se encuentra un quelante (EDTA)

que es quien permite secuestrar los Cationes (Calcio y Magnesio) que son necesarios para que las

enzimas (DNasa y RNasa) actúen sobre ácidos nucleicos, de tal forma que si se secuestran los

iones de Calcio y Magnesio se puede disminuir la actividad de las enzimas.

6.2 Describir que compuesto pueden servir como detergente iónico y que función tiene

dentro del Buffer de Lisis

Los detergentes iónicos se dividen en Catiónicos y Aniónicos.

 Detergentes Catiónicos:
 El bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) es un detergente con cargas positivas, su función

dentro del Buffer de Lisis es favorecer la extracción del DNA, ya que este forma unos complejos

con el DNA que está cargado negativamente.

CTAB+EDTA+Tris HCl

 Detergentes Aniónicos:

Se dan las combinaciones entre detergentes como:

Sodio-duodecil sulfato (SDS) + PK (Proteinasa K)

6.3 Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde explique el

fundamento bioquímico de cada una de las etapas de la extracción de ADN.

6.4 ¿Qué función cumple el etanol al final del proceso del lisado de la muestra?

En el proceso de lisado, la muestra preparada con sales y Buffer de lisis se pasa a una

columna la cual tiene una resina de afinidad al DNA, como el DNA esta aferrado a la columna,

esta se lava con etanol para así poder ir eliminando sales y otros componentes.

Básicamente, la función del etanol en este proceso, es el lavado de la muestra para eliminar

sales y demás componentes.

6.5 Realice una comparación e indique las ventajas y desventajas entre el método de

separación de ADN mediante métodos de columna (en inglés: Spin Column), y los métodos
caseros de extracción de ácidos nucleicos como fenol-cloroformo y Salting out. De una

breve fundamentación de estos métodos.

Separación de ADN

 Método de columna (Spin Column)

Es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos.

Este método se fundamenta en que el ácido nucleico se une a la fase sólida de sílice bajo ciertas

condiciones. El principio de extracción de este tipo de método se basa en la capacidad de

adsorción de los ácidos nucleicos en una columna de sílice ante la presencia de altas

concentraciones de sales caotrópicas.

 Fenol-cloroformo.

La extracción con solventes orgánicos se realiza mediante la mezcla del lisado celular con

fenol, cloroformo y alcohol isoamílico para la separación de los ácidos nucleicos, y las proteínas.

 Salting out.

Es un método para separar proteínas basadas en el principio de menos solubilidad de las

proteínas en altas concentraciones de sal. La concentración de sal necesaria para la proteína a

precipitar difiere de proteína a proteína.

COMPARACIÓN: Ventajas, y desventajas.

 Ventaja Desventaja
• Este método permite obtener • El rendimiento y la calidad del ADN
Método de muestras de una gran pureza. (o ARN) obtenido depende de la
columna (Spin • Las muestras obtenidas presentan cantidad y calidad de la muestra de
Column) una integridad muy alta. partida.
• Amplifica por PCR fragmentos de
ADN de gran tamaño.
• Alto rendimiento. • Restos de solventes orgánicos
Fenol- • Puede ser utilizado para la obtención contaminan la muestra.
Cloroformo de ADN de diferentes tipos de • Restos de fenol o cloroformo
muestra. pueden afectar a las relaciones de
absorbancia indicativas de la pureza
de la muestra.
• La pureza del ADN obtenida con el
método de precipitación por sales es
muy alta.
Salting out. • Las muestras de ADN obtenidas con
este protocolo se pueden considerar
muestras de una integridad muy alta.

6.6 Explique cómo se puede analizar la calidad y pureza del ADN purificado ¿Cómo se

puede asegurar que el producto final de extracción es Acido desoxirribonucleico (ADN) y

no Ácido ribonucleico (ARN)?

A través de espectrofotometría se consigue determinar la concentración, y pureza de una

muestra de ADN. Fundamentándose en la capacidad de absorción de un compuesto presente en

una solución a una longitud de onda determinada. Se puede asegurar que el producto es ADN, y

no ARN mediante las bases nitrogenadas de ambos nucleótidos. Si posee Timina (T) es ADN,

por el contrario, posee Uracilo (U) es ARN.

6.7 Describa cómo se realiza la cuantificación de ácidos nucleicos mediante

espectrofotometría ¿Cuál es el componente del ADN que absorbe a la longitud de 260nm y

para que puede servir esta característica en la cuantificación del ADN? ¿Qué sustancias
absorben a 280nm? ¿Qué se puede decir si un extracto de ADN presenta un radio de

absorbancia 260/280:>1.8?

El espectrofotómetro consiste en la transmisión de la luz a través de una solución para

establecer la concentración de un soluto presente en la misma. Funciona conforme a un principio

inteligible: Con una radiación luminosa irradia una muestra de longitud de onda conocida, y

mide la energía luminosa dada con una célula fotoeléctrica ubicada detrás de la muestra.

La absorción máxima del ADN y ARN corresponde a 260nm, y de las soluciones proteicas a

280nm. Debido a que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280nm, y las

proteínas tienen un comportamiento similar a 260nm. Los coeficientes de los valores descritos

proporcionan una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos aproximadamente entre

1.8 y 2.0

6.8 Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de ácidos nucleicos

El ADN genómico suele extraerse para uso en procesos como PCR cualitativo, determinación

de variantes, diagnostico, modificaciones o alteraciones genéticas, estudio de expresión genética.

CONCLUSIÓN

Los métodos de extracción del ADN permiten la obtención de ácidos nucleicos purificados a

partir de diferentes fuentes para así después lograr conocer su estructura y poder realizar análisis

específicos de modificaciones genéticas. Para la extracción de los ácidos nucleicos, es preciso

provocar una lisis celular, romper las membranas celulares y separar los ácidos nucleicos de los

restos de células; Tras la lisis celular, los restos de células se eliminan fácilmente por una

precipitación con altas concentraciones salinas, y así se pueda sacar el ácido nucleico con sales

fácilmente; Se remueven los restos de sales por medio de un lavado (Isopropanol 100% y Etanol
70-95%), y se rehidratan los ácidos nucleicos (Buffer TE); Finalmente, estos quedan listos para

ser almacenados.

INFORME LABORATORIO ELECTROFORESIS

OBJETIVOS

 Comprender la técnica de electroforesis en gel de agarosa para el análisis de ácidos

nucleicos.

1. ¿Qué diferencias existen entre una electroforesis en gel y una capilar? ¿Mencione

ventajas y desventajas de cada una? ¿Utilidad?

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras

macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga.

Ventajas

 No presentan fenómenos de absorción.

 Pequeñas cantidades de muestra.

 La movilidad electroforética se debe a su densidad de carga y tamaño.

 Mejor visualización y resolución.

 No desnaturaliza las muestras.

 Las muestras pueden ser recuperadas.

 Desventajas

 Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución.

 Tiempos de análisis largos.

 Análisis cuantitativo impreciso.

 Difícil de automatizar.

 Voltaje limitado (20-200v/cm).

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar es una técnica utilizada para separar las diferentes moléculas

presentes en una disolución de acuerdo con la relación masa/carga de las mismas.

Ventajas

 Mejor capacidad de calor.

 Técnica automatizada, ofreciendo resultados reducibles y precisos.

 Separa cualquier tipo de tamaño: moléculas de alto y bajo PM.

 Utiliza volúmenes muy pequeños de muestra (0.1-10 nL)

 Alta resolución.

 Disminución del tiempo de análisis.

 Rápida separación (1-45 min).

Desventaja: La vulnerabilidad a el cambio de sus componentes.

Diferencias entre Electroforesis en gel y Electroforesis capilar

 La electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida consume más tiempo y recursos, son

menos específicas y reproducibles, y generalmente requieren mayor cantidad de muestra, por lo

que actualmente se encuentran casi en desuso.

A diferencia de la electroforesis en gel, la electroforesis capilar contribuye principalmente en

dos áreas del diagnóstico genético, una de ellas es a través de la secuenciación y la otra es por

medio del análisis de fragmentos en los cuales es posible determinar la dosis génica de forma

cuantitativa, esta es una técnica de alta sensibilidad y resolución que puede realizarse en unos

minutos y que requiere pequeñas cantidades de muestra, utiliza menos reactivos y es

automatizable.

2. Realice un comparativo entre la electroforesis y la cromatografía de capa fina a nivel de

la metodología y la utilidad.

Electroforesis Cromatografía
• La electroforesis es una técnica de • La cromatografía en capa fina se
laboratorio que usamos para analizar basa en la preparación de una capa,
una muestra usando las propiedades uniforme, de un adsorbente
eléctricas de las especies químicas mantenido sobre una placa de vidrio
presentes en esa muestra. u otro soporte.
Metodologí • La electroforesis es un método de • Es una técnica analítica que usamos
a separación de biomoléculas como el para analizar muestras usando los
ADN o ARN de acuerdo a su tamaño, coeficientes de partición de las
permitiendo además su aislamiento especies químicas presentes en la
cortando la zona de interés. muestra.
 • Permite una observación directa de • Permite determinar el grado de
cada fragmento separado directamente pureza de un compuesto.
en el gel, ya que, su tinción mediante
• La cromatografía puede ser usada
un compuesto llamado bromuro de
para compuestos líquidos, sólidos y
etidio, hace visible al ADN o ARN
gaseosos.
(fluorescente) mediante la emisión de
Utilidad
luz ultravioleta.
• Generalmente la electroforesis se
realiza solo en compuestos líquidos y
sólidos.

3. Explique qué beneficios trae usar Buffer Tris acetato y EDTA (TAE), Tris-borato (TBE),

o Tris-fosfato (TPE) como buffers electroforéticos y cuáles son las diferencias en utilidad de

estos Buffers.

Beneficios del uso del Buffer Tris acetato EDTA (TAE)

 Menor capacidad de amortiguación que el TBE.

 Ideal para recuperación de DNA y manipulaciones en gel.

 Baja fuerza iónica.

 Mejor resolución de grandes fragmentos de ADN:> 12Kb

Una de las desventajas del TAE como buffer de electroforesis es que no permite reciclarlo por

más de tres corridas electroforéticas seguidas.

Beneficios del uso del Buffer Tris-borato EDTA (TBE)

 Es ideal para separación de DNA y RNA en geles de corridas largas o alto voltaje.

 En comparación al TAE, el empleo del TBE como buffer de electroforesis es

particularmente útil para discriminar a pequeños fragmentos de DNA en geles de agarosa.

  Su efectividad permanece inalterada durante 3 o 4 días, sin importar el número de

corridas electroforéticas realizadas.

Diferencias entre el buffer TAE y TBE

 Migración: El TAE es mejor para el análisis electroforético de fragmentos

grandes de ADN (900 – 2000bp) ya que corren más rápido y tiene mayor capacidad de

discriminación en un gel de agarosa a 0.8%. Mientras que en TBE para fragmentos

pequeños de ADN (100 – 500bp) corren más rápido y tiene mayor capacidad de

discriminación en gel de agarosa al 2%.

 Capacidad tamponante: El TBE es más estable y tiene una capacidad tampón

más alta que el TAE.

 Reciclaje: El TAE no aguanta más de 3 corridas de electroforesis seguidas sin

alterar sus propiedades, mientras que el TBE dura 3 o 4 días independientemente de las

corridas de electroforesis realizadas.

 Recuperación del ADN: El TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa, lo

que provoca una recuperación baja del ADN.

4. Explique por qué es necesario usar un Buffer de carga en la electroforesis y cuál es la

finalidad de cada uno de sus componentes.

El Buffer de carga es importante debido a que contiene un colorante que es manipulado para

visualizar la migración del DNA durante el transcurso de la Electroforesis. Sus componentes

cumplen varios propósitos, tales como:

Electroforesis de DNA

 Glicerol: Aporta densidad a la muestra, y facilita su aplicación en los “pocillos”.

  Azul de bromofenol (u otros colorantes como xileno-cianol): Marcador de

frente de avance de la electroforesis, su color resulta una ayuda visual durante la carga de

muestra en los “pocillos”. También cumple la función de ser un tampón para estabilizar el

pH, y la carga de las moléculas.

Electroforesis de proteínas

 Glicerol: Aporta densidad a la muestra, y facilita su aplicación en los “pocillos”.

 Azul de bromofenol: Marcador de frente de avance de la electroforesis, su color

resulta una ayuda visual durante la carga de muestra en los “pocillos”.

 SDS: Provoca desnaturalización en las proteínas (con un calentamiento transitorio

de 90-100*C)

B-Mercaptoetanol: Rompe enlaces de disulfuro, tampón estabilizador de pH, y la carga de

moléculas.

5. ¿Qué diferencia hay entre Westernblot, Southernblot y Northernblot?

Western blot es una técnica utilizada para localizar una proteína especifica en una muestra de

sangre especifica de sangre o tejido. (Implica el uso de electroforesis en gel para separar las

proteínas de la muestra). Determina la presencia, y cantidad de antígenos y anticuerpos. Por otro

lado, el Southern blot es un método que permite hallar la presencia de una secuencia de ADN.

(Emplea la electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos de ADN de acuerdo con

su longitud), y, el Northern blot es similar a la técnica de Southern blot, pero permite detectar

ARN. (Separación de células por tamaño mediante electroforesis en gel).

6. ¿Si deseara detectar una molécula específica de ADN después de un corrido

electroforético como lo haría? Menciones los pasos que realizaría, el tipo de marcaje y la

interpretación del resultado.

 Se emplea el método de Southern blot (RFLP), donde se utilizan sondas de ADN con un tipo

de marcaje sobre las moléculas radioactivas, y con una secuencia conocida para identificar qué

bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda,

Después del recorrido de la electroforesis realizamos los siguientes pasos:

 Preparación de un ensayo de Southern.

 Hibridación con sonda radioactiva

 Detección de los RFLPs mediante autorradiografía.

 Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales.

7. Describa el resultado obtenido a partir del bandeo que se formó en el gel de agarosa

tanto para el ADN extraído como para el amplificado de PCR. Explique qué relación tiene

los resultados frente al tamaño esperado, y frente a la calidad del ADN extraído y

amplificado. Explique si se formó una banda discreta, o si por el contrario se formó una

banda con un extremo degradado o manchoso explique qué posibles cambios en la siguiente

lista de factores podría estar interfiriendo en un adecuado proceso:

 La concentración y el tipo de agarosa de acuerdo al tamaño de la muestra de ADN

 El voltaje aplicado

 El buffer usado para electroforesis

 Calidad de las muestras o la extracción

A partir de los resultados podemos determinar que los fragmentos G5, y G6 no muestran pares

de bandas, a diferencia de los productos del PCR en donde todas las bandas amplificaron, este

fenómeno puede ser explicado a partir de una contaminación/calidad en la muestra.

 El ADN de G6 de PCR se está degradando

 La concentración del gel de agarosa es mayor, y fue migrada por más tiempo.
  El voltaje aplicado oscila entre 90V, debido a la alta concentración del gel de

agarosa. (Depende de la concentración del gel se aplica el voltaje)

 Buffer TAE por su mayor capacidad de resolución para tamaños grandes de ADN.

 La calidad de las muestras es deficiente debido a que tienen mucha energía

aplicada, por ende, se ven algunas bandas degradadas.

Consideraciones.

 Para evitar la degradación en las bandas, deben disminuir la energía (V) aplicada.

Volver a realizar el gel de agarosa.

CONCLUSIONES

 La electroforesis permite determinar el tamaño exacto de un fragmento.

 Una preparación mal hecha del gel hace que la resolución de las bandas obtenidas sea

más difícil de observar y analizar.

 El volumen de ADN y de buffer de carga debe ser exacto, si no, la práctica no

podría realizarse exitosamente, ya que, impediría una buena observación de los

resultados finales.

 La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más adecuadas para la

visualización del ADN, ya que, además de ser fácil de preparar, los colorantes nos

permiten su observación al someterlos a luz fluorescente.

REFERENCIAS
Alejos Velázquez, L. (2010). Extracción y purificación de ADN. Universidad Nacional
Autónoma de México.
Banco Nacional de ADN Carlos III. (2012). Programa Control de Calidad de Muestras.
Universidad de Salamanca.
Biocell Science. (2016). Obtenido de https://biocellsci.com/portfolio_page/buffer-tae-tris-acetate-
edta/
Checa Rojas, A. (26 de Octubre de 2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa. Conogasi.
Obtenido de http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-
agarosa/#:~:text=Descripci%C3%B3n-,La%20electroforesis%20es%20un%20m
%C3%A9todo%20de%20separaci%C3%B3n%20de%20biomol%C3%A9culas
%20como,cortando%20la%20zona%20de%20inter%C3%A9s.&text=Cuando%20una
%20
(s.f.). Cromatografía en placa fina. Obtenido de http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6-
guion.pdf
Fujimoto, K. (02 de Julio de 2012). SlideServe. Obtenido de
https://www.slideserve.com/kumiko/electroforesis-capilar
Gómez Martín, A. (08 de Marzo de 2012). Laboratorio de Ideas de Esquilo. Obtenido de
https://antoniogomezmartin.wordpress.com/2012/03/08/preparacion-tbe-tae/
Khan Academy. (s.f.). Obtenido de https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-
expression-and-regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis#:~:text=Electroforesis
%20en%20gel-,La%20electroforesis%20en%20gel%20es%20una%20t%C3%A9cnica
%20utilizada%20para%20separar,contiene%20las%20mol%
Laboratorio de Genómica Viral y Humana. (14 de Febrero de 2008). Scribd. Obtenido de
https://es.scribd.com/document/267726306/Gral-Buffer-TAE-TBE
Magaña, J., Arenas Sordo, M., & Gómez, R. (Julio de 2009). La electroforesis capilar como una
nueva estrategia en la medicina y el diagnóstico clínico. SciELO. Obtenido de
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-98872009000700014
Molina, N. (2006). Compración de métodos de lisis y extracción de ADN. Scielo.
Monografias Plus. (2015). Extracción de ADN Salting Out. Monografias Plus.
Montalvan, C. (20 de Agosto de 2016). Slideshare. Obtenido de
https://www.slideshare.net/cristhianyersonmontalvancoronel/electroforesis-exp
mort-sure.com. (28 de Enero de 2020). Obtenido de https://es.mort-sure.com/blog/difference-
between-electrophoresis-and-chromatography/#:~:text=La%20diferencia%20clave
%20entre%20la,se%20usa%20para%20la%20cromatograf%C3%ADa.
Orfao, A., & Morent, M. (2009). Extracción de ácidos nucleicos. Instituto de Salud Carlos II.
Ruiz Moleón, V., Garrote Santana, H., Díaz Alonso, C., Fernández Martínez, L., & Amor Vigil,
A. (7 de Octubre de 2016). Electroforesis capilar para el análisis de marcadores
oncohematológicos en el Instituto de Hematología e Inmunología. Revista Cubana de
 Hematología, Inmunología y Hemoterapia. Obtenido de
http://www.revhematologia.sld.cu/index.php/hih/article/view/538/527#:~:text=A
%20diferencia%20de%20la%20electroforesis,reactivos%20y%20es%20automatizable6
Somma, M. (2017). Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en
Muestras de Alimentos. Organización Mundial de la Salud Oficina Regional para
Europa.
TextosCientificos.com. (17 de Enero de 2007). Obtenido de
https://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
Wikipedia. (s.f.). Obtenido de https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_capilar#:~:text=La
%20electroforesis%20capilar%20(EC)%20es,masa%2Fcarga%20de%20las%20mismas