Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas
Departamento de Microbiología
Asignatura: Inmunología

Práctica 1: Células del Sistema Inmune. Tinciones

Introducción

El Sistema inmunitario (SI) está integrado por células, tejidos y órganos, a través de los cuales
cumple con la función de defensa contra agentes agresores exógenos y endógenos como
microorganismos y moléculas reconocidas como extrañas. Una de las actividades del bioanalista
en el laboratorio clínico, es la identificación y cuantificación de las células del SI en muestras
biológicas (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, moco nasal, heces, entre otras) con la finalidad
de diagnosticar una enfermedad (infecciosa, autoinmune, por hipersensibilidad o
inmunodeficiencia) y controlar su evolución. Esta tarea se ve facilitada por la aplicación de
diferentes técnicas de coloración para aumentar el contraste entre las distintas células y resaltar
sus características diferenciales, ya que las células observadas directamente al microscopio son
incoloras y con el mismo índice de refracción.

La examinación microscópica comienza con la realizacicón de un frotis o extendido sobre una

lámina portaobjeto, el cual debe someterse, en algunas ocasiones, a fijación para posteriormente
aplicar el procedimiento de coloración.

La fijación es el proceso por el cual se conservan y preservan en su posición las estructuras

internas y externas de las células para opbtener preparados duraderos que conservan la
estructura morfológica y química que presentaban las células y tejidos en estado vivo. La fijación
química puede realizarse con sustancias químicas, que varían según el procedimiento tintorial
que se aplicará posteriormente, son ejemplos el metanol (empleados para fijar frotis que serán
sometidos a la tinción de Gram y de Giemsa), el formol y la acetona fría. La fijación física,
emplea calor (la llama de un mechero) como agente fijador. La manera en la que actúan los
fijadores, sea físico o químico, es por inactivación de las enzimas y desnaturalización de
proteínas. Las cualidades de un buen fijador son: acción rápida, alto poder de penetración,
conservar las estructuras celulares y permitir procedimientos posteriores tales como la coloración.

Los colorantes son sustancias que confieren color a otros cuerpos y se define a la coloración
como el procedimiento mediante el cual un cuerpo toma color por la acción del colorante y no se
destiñe después del lavado con un solvente. El color adquirido por un cuerpo se puede explicar
por varias teorías. La teoría química admite que el colorante se une a una sustancia coloreable
(tejidos o células) formando sales insolubles, mientras que la teoría física sostiene que es un
fenómeno de adsorción. En el laboratorio, los colorantes más usados son los sintéticos (colorantes
de anilina), estos son sales y que poseen un grupo cromóforo, grupos con son los sintéticos
(colorantes de anilina), estos son sales que poseen un grupo cromóforo, grupos con dobles
enlaces conjugados que dan color al colorante y pueden unirse a las células o tejidos mediante
enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos.

1
Colorantes ácidos o aniónicos: cuando el ácido es el responsable del color y se uhnen a
estructuras con carga positiva, coloreando el citoplasma. Ejm.: eosina rosa de bengala y fucsina
ácida). Colorantes básicos o catiónicos: se caracterizan porque la base o grupos con carga
positiva proporciona el color, se unen a estructuras de carga negativa y colorean el núcleo celular.
Ejm.: azul de metileno). Colorantes neutros: cuando la base y el ácido son coloreados (tiñen el
núcleo de un color y el citoplasma de otro. Ejm: eosinato de azul de metileno. La coloración
puede ser simple (un solo colorante), como la del leucograma fecal, que emplea azul de metileno
y diferencial o combinada (dos o más colorantes), tal como la tinción de Gram o Ziehl Neelsen y
pancrómica cuando en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se
necesitan (Giemsa, Wrigth, Pappenheim).

En la práctica diaria del Bioanalista, estos procedimientos de coloración se aplican sobre un

extendido o frotis, los cuales son delgadas películas de la muestra biológica a estudiar, tales
como: sangre, líquido sinovial, heces, moco nasal, esputo, entre otras. Algunas coloraciones,
como la de Giemsa, requieren la fijación del frotis, el cual es un procedimiento que preserva la
estructura morfológica y química de las células y provocan la desnaturalización de las proteínas
del citoplasma, siendo el metanol, el fijador más empleado para tal fin.

Para la coloración de frotis de sangre periférica y médula ósea, se usan colorantes tipo
Romanowsky, estos consisten en una mezcla de eosinato de azur de metileno, eosinato de azul y
violeta de metileno. El azul de metileno colorea la cromatina y las sustancias azurófilas, mientras
que el violeta de metileno es el responsable de la coloración metacromática de granulaciones
basófilas. Los colorantes tipo Romanowsky son inactivos cuando están disueltos en metanol y
al agregar agua, precipitan y es cuando actúan, volviéndose inactivos de nuevo, cuando han
precipitado totalmente. La tinción de Wright y Giemsa son ejemplos de coloración tipo
Romanowsky.

Otras tinciones en las que se observan células del Sistema Inmune y del epitelio son las tinciones
de Gram y Ziehl-Neelsen (ácido-alcohol resistencia)

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 Preparación de frotis o extendidos

Para la realización de frotis, se deben usar láminas y laminillas limpias, desengrasadas con
solución jabonosa y alcohol 95%.

Sangre: Se recomienda usar sangre capilar o una gota de sangre sin anticoagulante para evitar la
alteración de la morfología celular. Hay dos formas de realizar el frotis, con láminas portaobjeto o
con laminillas cubreobjetos. Se deja secar y se procede a la tinción con Giemsa.
El procedimiento con Wright no requiere fijación de sangre

Frotis en lámina portaobjeto:

1. Coloque la lámina sobre el mesón y deposite una gota de sangre (10 ul aproximadamente)
2. Tome una segunda lámina y coloque sobre la gota. La sangre se distribuirá por capilaridad
3. Deslice la segunda lámina de manera uniforme hasta el otro extremo de la lámina del
mesón y deje secar. (Figura 1)

Cabeza Cuerpo
Cola

Zona Zona Zona

de ideal de
linfocit neutrof

Fig. 1

Frotis con laminillas: cubreobjeto:

1. Sostenga entre el pulgar y el dedo índice, una laminilla y deposite la gota de sangre en el
centro de la misma
2. Coloque la otra laminilla sobre la que contiene sangre, de tal manera queden formando
una estrella
3. Separe las laminillas por desplazamiento en direcciones opuesta (laminilla superior hacia
la izquierda y la otra hacia la derecha). Cuidando de no levantar las laminillas, deje secar.

3
   
1º laminilla deslizar
Laminilla deslizar

gota de sangre
2º laminilla

Fig.2

Orina:
Para aplicar la tinción de Gram, se realiza el extendido con orina sin centrifugar en una lámina
portaobjeto. Se fija con calor o metanol (se deja secar) y se tiñe con Gram.
Si se requiere realizar un recuento diferencial, se centrifuga la orina, se realiza el extendido con
el sedimento y se aplica la tinción de Giemsa (previa fijación con metanol) o de Wright (no
necesita fijación).

LCR:
Para el estudio citológico del LCR, como parte del estudio citoquímico o del cultivo, se
emplea el sedimento, ya sea para aplicar una tinción Giemsa o Wrigth, Gram o Ziehl-Neelsen.

Procedimiento del extendido:

 Centrifugar el LCR a baja revolución por 5 min (el tiempo puede variar según las normas de
procedimientos estandarizadas).
 Descartar el sobrenadante para el estudio químico y tomar el sedimento con pipeta Pasteur o
automática.
 Colocar la gota del LCR sobre una lamina y extender suavemente haciendo un óvalo pequeño.
 Dejar secar
 Fijar con metanol si se aplica la tinción de Giemsa o Gram. También se puede fijar al calor
cuando se aplica la tinción de Gram o Ziehl-Neelsen.
 Aplicar el procedimiento tintorial.

El análisis de LCR es considerado una emergencia médica, y la vida del paciente puede
depender de ese resultado. Cuando el LCR debe ser cultivado, el resultado de la tinción de Gram
es un dato de suma importancia que el médico le solicitará rápidamente al Bioanalista del
área de Bacteriología, para aplicar la terapia antibacteriana adecuada y garantizar la vida del
paciente.

Heces:
El frotis de las heces se realizará a aquellas muestras diarreicas que presenten moco y/o sangre.

Procedimiento del extendido:

 Tomar una pequeña porción del moco o de la sección con sangre con un aplicador de madera;
en caso de que al muestras sea líquida, usar una pipeta Pasteur desechable.
 Colocar sobre una lámina portaobjeto y extender haciendo un óvalo. Dejar secar.
 Aplicar el azul de metileno (no requiere fijación previa del extendido), tinción de
Ziehl-Neelsen o Kinyoun (para la identificación de Cryptosporidium e Isospora) o Gram.
Las tinciones de Gram y Kinyoun si requieren fijación.

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Secreciones y muestras en Hisopos:
Muestras nasales (incluyendo aquellos destinados a la investigación de eosinófilos con la
tinción de Hensel), secreciones vaginales, uretrales, oculares, óticas y de heridas son ejemplos de
muestras que pueden ser tomadas con hisopos. Estas muestras pueden estar destinadas al
cultivo, así que primero se siembran en los medios de cultivo apropiados y por último se realiza el
extendido.
Procedimiento del extendido:
 Tomar el hisopo y girar sobre la lámina, hasta hacer un extendido de 2 cm aproximadamente.
 Dejar secar, fijar (de ser necesario) y teñir.

Otros líquidos biológicos:

Procedimiento para líquido seroso:
 Centrifugar el líquido, el sobrenadante se emplea para el estudio químico y con el
sedimento se realiza el extendido.
 Tomar el sedimento con pipeta Pasteur o automática y colocar el volumen del líquido en la
lámina.
 Extender la muestra en la lámina hasta hacer un óvalo
 Secar al aire el extendido y fijar, si el procedimiento tintorial lo amerita.
 Aplicar la tinción de Giemsa, Wright, Gram, Ziehl-Neelsen para el recuento diferencial de
células.

Coloración de Wright para sangre periférica y otros líquidos biológicos

NO REQUIERE FIJACIÓN PREVIA

1. Realizar el frotis y dejar secar
2. Cubrir el frotis con solución colorante de Wright (7 gotas) por 2 minutos (en esta etapa
ocurre la desnaturalización de las proteínas por acción del metanol)
3. Colocar agua destilada (7 gotas), sople para mezclar hasta la formación de un brillo
metálico (en esta etapa ocurre la coloración)
4. Dejar actuar por 3 minutos
5. Lavar con agua y dejar secar
6. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis teñido y seco y colocar sobre la
gota una lámina o laminilla.
7. Observar al microscopio de campo claro con objetivo de 40X.

Resultados de la coloración de Wright

En una buena tinción, el frotis debe presentar un color rosado a simple vista.

Microscópicamente:
1. Los hematíes (glóbulos rojos): son de color rosado
2. Los núcleos de los leucocitos: azul púrpura
3. El citoplasma de los leucocitos neutrófilos maduros: rosado pálido
4. El citoplasma de los linfocitos: azul claro o azul intenso (células plasmáticas o linfocitos
reactivos)
5. El citoplasma de monocitos es azul-gris
6. Las granulaciones:
a. Neutrófilas: lila (granulaciones finas)
b. Eosinófilas. Naranja
c. Basófila: azul-negro o violeta ( son granulaciones gruesas)
d. Azurófilas: púrpura-rojizas

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 Polimorfonuclear neutrófilo: citoplasma rosado, granulaciones finas púrpura en el
citoplasma (como un punteado), núcleo muy lobulado azul púrpura

Basófilo: núcleo bilobulado azul púrpura (oculto por los gránulos) y citoplasma con
gran cantidad de gránulos negros

Eosinófilo: núcleo bilobulado azul purpura, citoplasma lleno de granulaciones

naranja

Linfocitos: núcleo compacto, azul púrpura y citoplasma azul celeste

Monocitos: núcleo arriñonado, laxo azul púrpura, citoplasma azul gris

Coloración de Giemsa

REQUIERE FIJACIÓN
1. Realizar el frotis y dejar secar
2. Fijar el frotis con metanol en cantidad suficiente para cubrir el frotis (1 min)
3. Eliminar el exceso o espere a que se evapore el metanol
4. Cubrir el frotis con solución colorante (5 min)
5. Lavar con agua y deje secar
6. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis teñido y colocar una lámina o
laminilla
7. Observar al microscopio con objetivo de 40X

Con la coloración de Giemsa se observan muy bien las granulaciones acidófilas, basófila los
leucocitos (núcleo, citoplasma y granulaciones) se observan de manera similar a la coloración de
Wright.

La observación al microscopio óptico de frotis de sangre periférica teñidos con estas

coloraciones forma parte del hemograma o hematología completa y ella permite realizar un
recuento diferencial de los leucocitos (fórmula relativa) que contribuye al diagnóstico de procesos
patológicos infecciosos o de otra naturaleza.

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Interpretación:
El valor de leucocitos en el hombre oscila entre 5.000-10.000 células /mm3, en recién nacidos de
10.000 – 25.000 mm3 y en niños de 1 año de 6.000 – 18.000/mm3

Valor en % de leucocitos Valor absoluto de leucocitos /mm3

Neutrófilos 40 - 75 2.000 - 7.000
Eosinófilos 1-6 0 - 450
Basófilos 0-1 0 - 200
Linfocitos 20 - 45 1.500 - 4.000
Monocitos 2 - 10 200 - 800

Las leucocitosis (aumento en la concentración de leucocitos) fisiológicas se pueden encontrar

en: recién nacidos y niños de 1 año de edad, al final del embarazo, en el parto y puerperio,
durante el esfuerzo físico violento, miedo, emociones intensas y en el calor extremo y altura.
Leucocitosis:
 Infecciosa: infecciones por bacterias y virus
 No infecciosa: dolor intenso, cirugías, posthemorragia, quemaduras extensas, neoplasias,
leucemias, infarto al miocardio e intoxicaciones

Leucopenia (disminución en la concentración de leucocitos):

 Infecciones por brucela y fiebra tifoidea
 Infecciones virales: varicela, sarampión, dengue, gripe
 Infecciones por protozoarios: malaria, kala-azar, tripanosomiasis
 Algunas micosis: histoplasmosis

Condiciones en las que ocurren alteraciones en las concentraciones de glóbulos rojos:

 Neutrofilia (incremento de neutrófilos, >10x109/litro): infecciones agudas bacterianas,
hongos, virus, procesos inflamatorios y traumatismo.

 Neutropenia (disminución de neutrófilos, <2x109/litro): infecciones bacterianas, virales

(gripe, mononucleosis, hepatitis, rubeola), por protozoarios (toxoplasmosis), enfermedades
autoinmunes (Lupus eritematoso sistémico).

 Linfocitosis (incremento de linfocitos, >4,0 x 109/litro): fisiológica (del 4to. mes de vida al
4to año de vida), en infecciones agudas (mononucleosis, tosferina, sarampión, rubeóla,
parotiditis) o crónicas (tuberculosis, brucelosis, sífilis).

 Linfopenia (disminución de linfocitos, <1,5x109/litro): inmunodeficiencias (de células B y T),

quimioterapia y corticoterapia.

 Monocitosis (incremento de monocitos, >10%): infecciones bacterianas (listeriosis,

tuberculosis, sífilis, brucelosis, endocarditis bacteriana sub-aguda), Lupus eritematoso
sistémico, colagenosis vascular, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de ovario, mama,
estómago y radioterapia.

 Eosinofilia (incremento de esosinófilos, >0,35 x109/litro): parasitosis por helmintos, alergias,

afecciones dermatológicas (psoriasis).

 Basofilia (incremento de basófilos), tiene escaso interés, puede observarse en casos de

leucemia y policitemia vera

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 Investigación de eosinófilos en moco nasal: Coloración de Hensel

El aumento de eosinófilos no se limita a la sangre periférica, también los eosinófilos tisulares

resultan un hallazgo importante en los procesos alérgicos. La investigación de eosinófilos en moco
nasal es un procedimiento rápido y fácil para evidenciar la eosinofilia tisular. Se le conoce como
citología nasal o citograma nasal y según el tipo celular predominante, se puede establecer un
diagnóstico diferencial, por ejemplo, abundantes neutrófilos con bacterias incluidas, hace pensar
en un proceso de etiología infecciosa bacteriana.

Procedimiento:
1. Dividir la lámina portaobjetos en dos e identificar como: I (fosa nasal izquierda) y D (fosa
nasal derecha)
2. Limpiar las fosas nasales del paciente: pedir que sople sobre un papel toalla (otras
muestras adecuadas son esputo y secreción bronquial)
3. Raspar suavemente la mucosa nasal con un aplicador con algodón estéril (uno para cada
fosa nasal)
4. Realizar el extendido haciendo giros sobre la lámina, deslizando suavemente para no
romper las células.
5. Fijar con metanol, cubriendo todo el frotis durante 1 minuto
6. Eliminar exceso de metanol o dejar que se evapore
7. Cubrir el frotis con eosina durante 15 min
8. Lavar con agua
9. Decolorar con metanol 1 min
10. Contrateñir con azul de metileno 1 min
11. Lavar con agua
12. Decolorar con metanol 1 min
13. Lavar con agua y secar
14. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y colocar una laminilla
15. Observar con objetivo de 40X.

Lo ideal es contar 100 células y expresar el resultado como porcentaje de cada tipo celular
encontrado.

Interpretación:
Negativo < 5%
Leve 5 - 10%
Moderado 10 - 50%
Abundante > 50%

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 Investigación de leucocitos en heces: Leucograma fecal

La diarrea se caracteriza por el incremento en la frecuencia de las evacuaciones (>3 al día), con
alteración en la consistencia (generalmente líquidas), asociadas o no a síntomas generales
(fiebre, escalofrio, nauseas y cólicos). El conocimiento de los síntomas clínicos, signos (leucocitos
en la materia fecal, sangre oculta y eosinofilia),aumentan la posibilidad de identificar el agente
etiológico y aplicar una terapia adecuada. El leucograma fecal permite identificar de una manera
rápida y fácil la presencia de polimornucleares (PMN) con una sensibilidad y especificidad del
75%. En diarreas de origen bacteriano (Salmonella, Shigella, E. coli, Campylobacter, etc.) y por el
protozoario Entamoeba histolytica, hay presencia de moco y PMN por una intensa respuesta
inflamatoria, mientras que en las diarreas de origen viral, están ausentes estas células.
En casos de enfermedad inflamatoria intestinal, como la colitis ulcerosa (afección de la mucosa
del colon), también se pueden encontrar PMN.

Procedimiento:
1. Realizar un extendido delgado en una lámina. Tomar el área con moco y/o sangre en las
heces. Dejar secar
2. Cubrir con azul de metileno por 5 min.
3. Lavar con agua. Dejar secar
4. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el extendido y cubrir con una laminilla
5. Observar al microscopio con objetivo de 40X: las células pueden ser polimorfonucleares
(PMN) (núcleos de color azul oscuro segmentados o multilobulares con citoplasma claro) o
mononucleares (1 núcleo azul oscuro y citoplasma claro)

PMN Mononucleares

Referencias Bibliográficas:
1. Di Fiore Mariano S. H. Diagnóstico histológico. Editorial Ateneo. Argentina.
2. Guía de trabajos prácticos de Hematología. Escuela de Bioanálisis. Universidad de
Cararbobo. 2001.
3. Mckenzie SB. Hematología clínica. 2da. Ed. Manual Moderno. Mexico. 2000.
4. Prescott L, Harley JP, Klein DA. Microbiología. 5ta. Ed. McGraw Hill Interamericana.
Mexico. 2004.

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Actividades de Laboratorio

Objetivos:
1. Realizar frotis o extendidos y aplicar la técnica de coloración apropiada para sangre, moco
nasal, heces u otras muestras disponibles.
2. Reconocer e identificar las células del Sistema Inmunitario:
 Sangre y otras muestras biológicas teñidas con Giemsa o Wright: Neutrofilos
(PMN), eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos
 Heces teñidas con azul de metileno o Gram: PMN y mononucleares.
 Moco nasal teñido con tinción de Hensel: eosinófilos, PMN y mononucleares
 Muestras biológicas teñidas con Gram: PMN, mononucleares y bacterias Gram positivas
y/o negativas.
 Muestras biológicas teñidas con Ziehl-Neelsen: PMN, mononucleares y bacilos acido-
alcohol resistentes y bacterias no ácido alcohol resistentes.

Actividades del facilitador:

1. Comentar la importancia de las técnicas de coloración en el diagnóstico y control de las
enfermedades en el ejercicio del Bioanálisis
2. Demostrar el procedimiento para la realización de extendidos o frotis en láminas y
laminillas.
3. Relacionar las variaciones leucocitarias con diversas patologías

Actividades del estudiante:

1. Realizar extendidos de sangre obtenida por punción capilar y venosa, moco nasal, moco
fecal y otras muestras biológicas.
2. Teñir los extendidos o frotis de:
a. Sangre con la tinción de Wright y Giemsa
b. Moco nasal con tinción de Gram y Hensel
c. Moco fecal con azul de metileno, Gram y Wright/Giemsa
d. LCR, orina y otras muestras biológicas con Gram y Wrigth/Giemsa.
3. Reconocer las células del SI en sangre, moco fecal, nasal y otras muestras biológicas.

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