Clase 3

Genética reversa

Genética clásica: se conocía un producto génico

(la proteína) y se trataba de identificar el gen

Genética reversa: genes identificados sólo por

su posición en el genoma, sin ningún
conocimiento de su función

Llamado también clonaje posicional

Anomalías cromosómicas ayudan a
identificar genes
Anomalía cromosómica balanceada junto con
fenotipo: clave de la posición
3 explicaciones:
Coincidencia
No es en realidad balanceada: hay pérdida o ganancia
de material
Uno de los rompimientos de cromosoma causa la
enfermedad. Puede interrumpir la secuencia
codificante o separarla de una secuencia reguladora
Translocaciones Xp21-autosoma en
mujeres con DMD ayudaron en la
identificación del gen
Recombinación
Segregación independiente
Dos cromosomas homólogos segregan
independientemente: un alelo en un locus de un
cromosoma segrega junto a otro alelo en otro locus de
otro cromosoma con una probabilidad del 50%
Loci en el mismo cromosoma
Alelos en loci en el mismo cromosoma cosegregan a
una tasa que está relacionada a la distancia genética
entre ellos

Esta tasa nos da la probabilidad de que una

recombinación ocurra entre dos loci = fracción de
recombinación (θ)

Loci muy alejados: fracción de recombinación es 0.5

Recombinante/ No recombinante
A la hora de formación de los gametos se debe dar
un número impar de recombinaciones entre dos
loci para poder detectar al cromosoma generado
como recombinante

Marcador 1

Marcador 2

N.R. 1 recombinación 2 recombinaciones

Fracción de recombinación nunca
mayor que 0,5
Valores de fracción de recombinación van de:
-0 para loci uno a la par del otro a
-0,5 para loci lejos uno de otro (o en diferentes
cromosomas)

Fracción de recombinación da una idea de la

distancia genética entre dos loci
Distancia genética
Unidad: centimorgan
1cM corresponde aproximadamente a una fracción
de recombinación de 1%
La fracción de recombinación no es una medida de
distancia genética aditiva, se usa una función para
transformarla en distancia en el mapa
Ej:
Función de mapa de Haldane transforma un θ=0,27 en
39cM
Función de mapa de Kosambi transforma un θ=0,27 en
30cM
 A2 A2 A2 A1 A1 A1 A2 A1
B2 B2 B2 B1 B2 B1 B1 B1

A2 A1 A1 A1
B2 B1 B1 B1

A2 A1 A1 A1 A1 A1 A2 A1
A1 A1
B2 B1 B2 B1 B1 B1 B1 B1
B1 B1
NR NR R NR R

La proporción de gametos recombinantes es la

fracción de recombinación entre los loci A y B
Distancia física/genética
Mapa físico muestra el orden de los genes en el
cromosoma y su distancia en kilobases o megabases

Mapa genético muestra el orden y la probabilidad de

que sean separados por recombinación

El orden es el mismo en ambos casos

La distancia sólo es igual si la probabilidad de

recombinación por megabase de ADN es constante
para todas las partes del cromosoma (no es cierto)
Distancia física/genética
Regla aproximada: 1cM = 1Mb

Pero existen “junglas” (>3cM por Mb) y “desiertos”

(0,3 cM por Mb) de recombinación

Existen “puntos calientes” de recombinación

También hay variación en los puntos de

recombinación entre sexos
Ligamiento
Dos loci están ligados si θ < 0,5

Objetivo del análisis de ligamiento: estimar θ y

determinar si θ < 0,5. Y si es <0,5 determinar si la
diferencia es significativa
Ligamiento es entre loci, no entre
alelos
Mapeo marcador/enfermedad
Se requieren marcadores en intervalos de no más
de 20-30 cM en el genoma

Esto implica varios cientos de marcadores

Análisis de ligamiento tradicional: aprox. 400

microsatélites. Hay sets probados (Weber)

También se puede hacer análisis de ligamiento con

SNPs (varios miles)
Análisis de ligamiento

Pasos:
Familia con herencia aparentemente mendeliana
Análisis de marcadores en todo el genoma para
individuos clave de la familia
Cálculo puntajes LOD
Análisis de haplotipos
Refinamiento
Identificar intervalo de interés
Siguiente paso
Identificación de genes candidatos en intervalo de
interés
Análisis de ligamiento

Determinar qué región del genoma comparten todos los

afectados y no la tienen los no afectados
Posibles causas de ligamiento

Más probable
Análisis de ligamiento requiere modelo

Especificar:
Autosómico o ligado al X
Tipo de herencia, penetrancias, frecuencia de
fenocopias
Frecuencia de alelo de la enfermedad
Frecuencia de nueva mutación
Mapeo de dos puntos
Generalmente en mapeo de dos puntos los dos
puntos son: marcador, enfermedad

Para determinar fracción de recombinación: en

casos sencillos se cuentan recombinantes y no
recombinantes

Cuando la fase no está clara hay programas para

determinar la probabilidad de ligamiento
Determinación fase
Colección de alelos en el mismo cromosoma : haplotipo

Genotipos Haplotipos
2 13 2 13
1 6 6 1
9 15 9 15
4 17 17 4
1 9 1 9
2 6 Reconstrucción 6 2
9 17 9 17
2 12 de haplotipos 2 12
7 12 7
12
6 14 6
14
1 7
7 1
18 18 18 18
1 4 1 4
10 10 10 10

Fase desconocida Fase conocida

Para determinar si hay ligamiento
Programas evalúan la probabilidad de una
determinada genealogía, bajo diferentes fracciones
de recombinación entre dos loci

La razón de probabilidad en análisis de ligamiento

sería:

L(θ)/L(0,5)

Denominador: probabilidad de nuestros datos si

no hay ligamiento
Para determinar si hay ligamiento
En análisis de ligamiento la prueba se formula en
términos del logaritmo base 10 de esa
probabilidad: el puntaje LOD

Z(θ)=log10L(θ)/L(0,5)

L(θ)= θk(1- θ) n-k n= meiosis informativas

k= recombinantes

• La fracción de recombinación más probable es

aquella para la cual el puntaje LOD es máximo
 22 11

1 1 2 1

N N D N

1 2 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 2

N D N N N N N D N D N D N N N N
recombinante
Todas las grises son meiosis no informativas. Son 8 meiosis informativas,
1 recombinante
Cálculo genealogía anterior
θ estimado= 1/8 = 0.125

Para θ= 0.125 L(θ)= θk(1- θ) n-k

L(0.125)= (0.125)1(1-0125)7

L(0.5)= (0.5)1(1-0.5)7

Puntaje LOD = Z(θ)=log10L(θ)/L(0,5)= 1.099

Software para ligamiento
Allegro
Fastlink
Genehunter
Linkage
S.A.G.E
SuperLink
Vitesse
Puntaje LOD
Me dice si hay evidencia de ligamiento entre dos loci
Generalmente:
Locus 1 es un marcador molecular
Locus 2 es el locus de la enfermedad

Puntaje LOD > 3 es evidencia ligamiento. Puntaje de 3

debido al azar se obtiene sólo 1/20 veces.

Exclusión de ligamiento: LOD < -2

LOD „sugerente de ligamiento“ entre 2 y 3

Probabilidad de encontrar ligamiento
depende de LOD
Probabilidad a posteriori de encontrar ligamiento
dado un LOD:

LOD de 1: 17% probabilidad ligamiento

LOD de 2: 67% probabilidad ligamiento
LOD de 3: 95% probabilidad ligamiento

En 5% de los casos no hay gen responsable, cuando el

LOD es 3
Puntaje LOD de dos puntos, todo el
genoma
Suma de familias
Cuando se tienen varias familias, los puntajes LOD se
pueden sumar entre familias

Para hacer esto hay que estar ABSOLUTAMENTE

SEGURO de que se trata del mismo fenotipo
(importancia del diagnóstico)
Análisis multipunto

El análisis de ligamiento es más eficiente si se analizan

al mismo tiempo datos de más de dos loci

Ayuda a establecer orden correcto de los marcadores

Ayuda a sacar información de marcadores poco

informativos. Se trata a un haplotipo como un
marcador

El pico más alto indica la posición más probable

Beneficio de genotipar individuos adicionales
Aumenta puntaje LOD

Se presentan aumentos máximos, cuando θ es 0

Autosómica dominante:
Individuo adicional no afectado: aumenta 0,3
Individuo adicional afectado:aumenta 0,3

Autosómica recesiva:
Individuo adicional no afectado: aumenta 0,12
Individuo adicional afectado: aumenta 0,6
Estimar poder
Caso más sencillo: estimar cuántas meiosis
informativas se requieren para llegar a LOD de 3

Casos más complejos: programas para estimar

poder de la familia. Ej: Simlink, SLink
Refinamiento del mapeo
Ideal tener el mayor número de meiosis posibles:
mayor probabilidad de un evento de
recombinación que refine el intervalo

Familias en humanos no muy grandes, limita la

resolución

Ventaja de estudiar familias en América Latina,

más hijos que en otros países

Para refinar el mapeo se analizan haplotipos

Ejemplo Análisis Ligamiento,
glomerulopatía

joven
Refinamiento del mapeo
Mapeo por homocigosis
Personas con enfermedades recesivas raras en
familias con consanguinidad, son probablemente
autocigotas para los marcadores ligados al locus de
la enfermedad

Autocigosis: homocigosis para marcadores

idénticos por descendencia, heredados de un
ancestro común reciente

No funciona en poblaciones sin uniones

consanguíneas
Identidad por descendencia
Mapeo por homocigosis

Si el hijo es homocigota para un alelo podría ser

por autocigosis o por una 2a copia del mismo alelo
que entró independientemente a la familia

Entre más poco común es el alelo hay >

probabilidad de que homocigosis represente
autocigosis

Regiones homocigotas en todos los afectados

serían regiones candidatas para tener al gen que
causa la enfermedad
Mapeo por homocigosis

En este caso, familias consanguíneas muy

pequeñas pueden dar puntajes significativos

Método ha sido aplicado con éxito en el

descubrimiento de genes recesivos para sordera
Mapeo por homocigosis
Homocigosis con microsatélites

Papá

Mamá

Hijo sano 1

Hijo enfermo

Hijo sano 2
Mapeo por homocigosis
en familias
Problemas con análisis de
ligamiento
Posibilidad de errores
Errores al „leer“ los marcadores causan errores en
el resultado

Casos de no paternidad

Si se produce un genotipo que no es posible el

programa de computadora lo detecta. El problema
es cuando los errores podrían ser posibles

Indicador de error, dobles recombinantes muy

cercanos

Más grave: errores en diagnóstico

Problemas de cómputo
Con genealogías muy grandes el tiempo de análisis
se vuelve muy largo

Muchos programas no logran analizar la familia

completa

Los programas estiman los haplotipos, errores de

genotipado pueden llevar a haplotipos erróneos

Si dos haplotipos son igualmente posibles, el

programa podría „decidirse“ por el equivocado
Heterogeneidad de locus
Es común que mutaciones en diferentes genes
causen el mismo fenotipo

El mezclar familias en las que la causa de la

enfermedad no es la misma en un análisis de
ligamiento puede enmascarar la señal de
ligamiento

Con enfermedades recesivas está la complicación

de que hay que mezclar muchas familias pequeñas.
Solución: mapeo por homocigosis
Resolución limitada del mapeo meiótico
La resolución depende del número de meiosis
analizadas

Familias humanas están limitadas en este aspecto

En las últimas generaciones: aún más marcado

Casi imposible encontrar una única familia con

suficiente poder estadístico para detectar
ligamiento
Análisis de ligamiento requiere modelo

Análisis de ligamiento requiere por lo general un

modelo con modo de herencia, penetrancia,
frecuencias génicas

Opción: análsis no paramétrico o „libre de

modelo“. Pero tiene menor poder (próxima clase)
Siguiente paso
Cuando análisis de ligamiento es exitoso se obtiene
una región candidata

El tamaño de la región varía

Se identifican todos los genes en esa región

Esto es hoy en día mucho más fácil que en el pasado

Gracias al proyecto de genoma humano, muchos de los

genes en una región son conocidos
Genes en la región candidata

UCSC, Universidad de California en Santa Cruz

Lista de todos los genes en la región candidata

http://genome.ucsc.edu/
Estrategia de análisis de genes
Establecer prioridades

Genes expresados en tejido de interés

Genes cuya función „calza“ con lo esperado, o en la vía

metabólica apropiada

Genes en regiones altamente conservadas

Homología con genes de los que se sabe que tienen

expresión o función apropiada
Búsqueda de mutaciones
Mutación en los afectados y no presente en los no
afectados

No tan sencillo
Algunos genes son muy grandes
Algunas mutaciones no están en la región codificante o
son a nivel de cromosoma
Dificultad de distinguir polimorfismo raro de mutación
Evidencia a favor

Alta conservación

Diferentes mutaciones en diferentes familias

Mutaciones en grupos de pacientes esporádicos

Efecto sobre estructura de la proteína

Efecto sobre la función de la proteína

Análisis de ligamiento sólo para enfermedades
mendelianas
No ha sido exitoso con enfermedades complejas

Por lo general se requiere modelo

La estrategia ha sido tomar familias con una

enfermedad compleja en la que la herencia aparenta
ser mendeliana esperando encontrar un gen
importante para casos esporádicos

En la práctica no ha sido exitoso: no se identifica el

gen, o se identifica pero no es importante en la
población general
Pedfile
Columna 1: Familia
Columna 2: Identificador de individuo
Columna 3: Papá si individuo es fundador se
pone un 0
Columna 4: Mamá
Comuna 5: Sexo 1=Masculino, 2= Femenino
Columna 6: Afección 0=desconocido, 1=Sano,
2=Afectado
 Pedfile

mamá sexo afección

familia individuo papá
Penetrancia incompleta
Si la penetrancia incompleta es generalizada se
incluye en archivo con parámetros

Si la penetrancia es dependiente de la edad porque

hay variación en la edad de inicio: se usan „liability
classes“. Se agrega una columna al pedfile.
 ? ?

Familia
II:3 II:4

Pterigión

? ? ?

III:4 III:5 199 III:7 III:8 305 228 III-11 223 211 225 193 212 III-12

213 214 217 310 311 313 301 296 287 220
Pedfile peterigión básico
Pedfile pterigión con “liability”

Clase 1: se enferman 50%

Clase 2: se enferman 80%

Tarea
Hacer pedfile a partir de genealogía

Hacer genalogía a partir de pedfile