Determinación de la Temperatura y pH
óptimo de la enzima alfa-amilasa
Quintero, Meilyz1; Morales, Julissa2
CIP: 4-896-1369 CIP: 1-749 376
Muñoz, Ariadny3; Pimentel, Tiannys4
CIP: 4-808-1722 CIP: 4-810-1523
Rodríguez, Luis5
CIP: 4-808-892
Curso de Bioquímica Humana (300), Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Chiriquí. David, Chiriquí,
República de Panamá, e-mail: Meilyz.quintero@unachi.ac.pa1, julissa.morales1@unachi.ac.pa2,
ariadny.munoz@unachi.ac.pa3, tiannys.pimentel@unachi.ac.pa4, luis.rodriguez6@unachi.ac.pa5
Resumen positivo y el test de Benedict negativo porque
la enzima no degrado su sustrato, es decir no
Este laboratorio consistió en preparar 16
hubo actividad enzimática. El tubo 2 fue
tubos con mezclas de sustancias distintas
preparado con las mismas sustancias que en
como: maltosa, agua desionizada, amilasa
el tubo 1 pero en este caso se incubó, la
(enzima), almidón (sustrato). Entre los
prueba de IKI fue negativa pues el almidón se
distintos tubos se variaron las condiciones,
degrado resultando en un azúcar simple como
por ejemplo, algunos fueron expuestos a
la maltosa por lo que la prueba de Benedict
temperaturas bajas o altas con pH de 7.0 o
fue positiva, es decir, hubo actividad
ácidos como el pH: 2.0. y se utilizaron dos
enzimática. El tubo 4 fue preparado con la
reactivos para observar la presencia o
enzima, pH: 7 pero sin el sustrato por lo que
ausencia de actividad enzimática: prueba de
IKI fue negativa y Benedict negativa pues
IKI (yoduro de potasio) y prueba de
toda enzima necesita actuar sobre su sustrato
Benedict. Por consiguiente, cuando IKI se
(almidón). El tubo 7 se preparó con la
muestra negativa (color amarillo) es porque
enzima, sustrato y un pH de 2.0, siendo IKI
no detecta azucares como el almidón
positiva y Benedict positiva (color naranja
mientras que Benedict positiva (color
claro) es decir la actividad enzimática fue
naranja) al detectar azúcares simples, esto es
ligeramente visible. Esto significa que la
un indicativo de actividad enzimática. Tales
enzima para actuar necesita un pH óptimo de
preparaciones tuvieron como fin analizar la
7.0, una temperatura de 37 ºC y estar en
acción de la amilasa en los distintos tubos y
presencia de su sustrato, alguna variación en
explicar la manera en que el pH y la
estas condiciones cambiará la actividad
temperatura impactan a la enzima. El tubo 1
enzimática.
por ejemplo, se preparó con la enzima
(amilasa), su sustrato (almidón), pH: 7 a una
temperatura alta, el resultado de IKI fue
Palabras claves soluciones buffer de pH 2.0, 7.0, 9.0 y agua
desionizada.
Prueba de Benedict, Prueba de Yoduro de
potasio, Catalizador, Sustrato, Especificidad Tabla 1. Materiales y reactivos
Objetivos MATERIAL CAPACIDAD CANTIDAD
✓ Explicar la influencia de la Tubos de ----------------- 16
temperatura y pH en la actividad de la ensayo
amilasa.
✓ Examinar la especificidad de la Pipetas ----------------- 16
amilasa
✓ Comprobar la actividad enzimática Placa ----------------- 1
calefactora
utilizando la prueba de Benedict e IKI
Marco teórico Congelador ----------------- 1
En esta experiencia de laboratorio virtual, se REACTIVO CANTIDAD CONCENTRACIÓN
determinó la temperatura y pH óptimo de la Amilasa ----------------- ------------------------
enzima alfa-amilasa. La enzima alfa-amilasa,
es una enzima que cataliza la hidrólisis de los Almidón ----------------- ------------------------
enlaces alfa-glucosídicos, de los
polisacáridos alfa glucosídicos de alto peso pH 7 ----------------- ------------------------
molecular, como el almidón y el glucógeno, pH 9 ----------------- ------------------------
liberando glucosa y maltosa. (Barlow, 2000).
Para esto, se utilizaron dos pruebas, la prueba pH 2 ----------------- ------------------------
de Benedict y la prueba de Lugol. La prueba
del yodo (Lugol) determina la presencia o Agua ----------------- ------------------------
desionizada
alteración de almidón u otros polisacáridos.
(Gutiérrez, 2004). Por otro lado, la prueba Maltosa ----------------- ------------------------
de Benedict determina la presencia de
azúcares reductores como la lactosa, la Reactivo de ----------------- ------------------------
glucosa y la maltosa. El fundamento de esta Benedict
prueba, se basa en que, en un medio alcalino,
IKI ----------------- ------------------------
el ion cúprico se reduce a su forma Cu+ por
efecto del grupo aldehído del azúcar. Este
ion, se observa como un precipitado rojo
ladrillo correspondiente al óxido cuproso
(Cu2O). (Bonnet, 1974). Con el objetivo de
lograr la determinación de la temperatura y el
pH óptimo de la alfa-amilasa, se utilizaron 8
tubos a los cuales se le aplicaron distintas
condiciones, como ebullición y congelación.
Se utilizaron diferentes reactivos, amilasa
(enzima), almidón (sustrato), maltosa y
Procedimiento Ilustración 4. Procedimiento para tubo 4
Ilustración 1. Procedimiento para tubo 1
Ilustración 5. Procedimiento para tubo 5
Ilustración 2. Procedimiento para tubo 2
Ilustración 6. Procedimiento para tubo 6
Ilustración 3. Procedimiento para tubo 3
Ilustración 7. Procedimiento para tubo 7 Resultados
Tabla 2. Resultados con Lugol. Parte A
Tub Contenido pH Prueba de
o Lugol
1 Amilasa + 7 Positivo
Almidón
2 Amilasa + 7 Negativo
Almidón
Ilustración 8. Procedimiento para tubo 8
3 Amilasa + 7 Negativo
Almidón
4 Amilasa + 7 Negativo
Agua
desionizada
5 Agua 7 Positivo
desionizada +
Almidón
Ilustración 9. Parte A y B del laboratorio 6 Agua 7 Negativo
desionizada +
Maltosa
7 Amilasa + 2 Positivo
Almidón
8 Amilasa + 9 Positivo
Almidón
Tabla 3. Resultados con Benedict. Parte B
Tubo Contenido pH Prueba de
Benedict
1 Amilasa + 7 Negativo
Almidón
2 Amilasa + 7 Positivo la enzima ya no puede unirse a su sustrato de
Almidón manera adecuada y no ocurren reacciones. En
este caso, al no ser una variación tan extrema
en el pH hubo una reacción parcial.
3 Amilasa + 7 Positivo
Almidón 2. ¿Qué efecto tuvo la ebullición sobre la
actividad enzimática? ¿Por qué?
4 Amilasa + 7 Negativo La ebullición desnaturaliza la proteína, es
Agua decir cambió la conformación tridimensional
desionizada de la misma y, al ser la enzima, es decir la
alfa-amilasa, una proteína; perdió su
5 Agua 7 Negativo actividad enzimática, por lo que no fue capaz
desionizada + de degradar el almidón. A temperaturas altas,
Almidón la actividad enzimática suele aumentar ya
que las moléculas reactantes se mueven más
6 Agua 7 Positivo rápido para generar más colisiones con las
desionizada + enzimas, pero a temperaturas superiores a
Maltosa 50°C se altera la estructura terciaria y por
ende hay una pérdida en la actividad
7 Amilasa + 2 Positivo enzimática, en este caso al aplicar una
Almidón temperatura de 100°C se desnaturaliza la
proteína lo que causó la pérdida de la
actividad enzimática. Además, al ser la alfa-
8 Amilasa + 9 Positivo
amilasa una enzima humana, presenta una
Almidón
temperatura óptima de aproximadamente
37°C, que es la temperatura corporal normal.
Por lo que, al ser expuesta a temperaturas más
Cuestionario altas, como en este caso los 100°C o más
bajas, afectarán su actividad enzimática.
1. ¿A qué pH vio la mayor actividad de la
amilasa salival? ¿Por qué? 3. ¿La congelación tuvo algún efecto sobre
la actividad de la amilasa? Explique
La mayor actividad enzimática de la amilasa
salival se vio a un pH de 7.0. Esto, se debe a La congelación permite conservar las
que el mismo es el más aproximado al pH sustancias, es decir se conservan las
óptimo de la amilasa, el cual es de 6.9 propiedades enzimáticas, por lo que al aplicar
aproximadamente. Las enzimas son más la prueba de Benedict se pudo comprobar la
activas a su pH óptimo, ya que este mantiene degradación del almidón en azúcares
la estructura terciaria de la proteína. Cuando simples. Es decir, la congelación aplicada
el pH está por debajo o arriba del pH óptimo, previamente permitió conservar las
como por ejemplo cuando se aplicó el pH de propiedades de la proteína, por lo tanto, su
9.0, se alteran las interacciones de los grupos actividad enzimática no se vio afectada y se
R, lo que destruye la estructura terciaria y el llevó a cabo satisfactoriamente.
sitio activo de la proteína y por consiguiente,
Discusión y los efectos sobre el estado cargado de la
enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas
En el tubo 1, la enzima perdió su actividad
cuyo mecanismo comprende catálisis acido
enzimática debido a la alta temperatura
básica, los residuos comprendidos deben
(100°C), es decir que la enzima no degradó el
estar en el estado de protonación apropiado
almidón, por esto la prueba de IKI resultó
para que la reacción proceda. (Murray y col.,
positiva (tabla 2), tornándose un color
2010).
grisáceo, indicando la presencia de almidón;
mientras que la prueba de Benedict el En el tubo 4 tanto la prueba de IKI (tabla 2)
resultado fue negativo (tabla 3) y Benedict (tabla 3) resultaron negativas ya
evidenciándose color celeste, ya que la que solo hay enzima, no hay sustrato
enzima no degradó el almidón, ósea no hay (almidón).
presencia de azúcares simples. El aumento de
El tubo 5 que contenía agua desionizada y
la temperatura incrementa el índice de
almidón da positivo (tabla 2) para la prueba
reacciones tanto no catalizadas como
de Lugol y negativo (tabla 3) para Benedict,
catalizadas por enzima al aumentar la energía
ya que reconoció el almidón por lo que se
cinética y la frecuencia de choque de las
obtiene un color azul negruzco para Lugol,
moléculas que están reaccionando. Sin
pero este no contiene ninguna enzima que lo
embargo, la energía calorífica también
degrade. En términos de hidrólisis indica que
aumenta la energía cinética de la enzima
para la prueba de Lugol no hubo una
hasta un punto que excede la barrera de
hidrólisis, pero (Aguiar, Carrillo, Díaz, &
energía para alterar las interacciones no
Parreño, 2014) explican que la coloración
covalentes que mantienen su estructura
azul negruzca se da, porque los átomos de
tridimensional. La cadena polipeptídica
yodo se introducen entre las espirales
empieza entonces a desdoblarse, o
conduciendo a una fijación o absorción de
desnaturalizarse, con una pérdida
yodo en las moléculas de almidón. En
acompañante de la actividad catalítica.
comparación el tubo 6 que contenía agua
(Murray y col., 2010).
desionizada y maltosa da negativo (tabla 2)
En el tubo 2 a bajas temperaturas y en el tubo para la prueba de Lugol y positivo (tabla 3)
3 a una temperatura normal, la prueba IKI para la prueba de Benedict, alcanzando una
resulto negativa (tabla 2) evidenciándose de coloración amarilla y color ladrillo,
color amarillo, mientras que la de Benedict respectivamente. El indicativo que muestra el
fue positiva (tabla 3) tornándoseos de color resultado positivo para prueba de Benedict
rojo ladrillo; estos resultados se deben a que señala que hay una abundancia de azúcar
hubo actividad enzimática, es decir no hubo reductor, que mediante una reacción redox,
una condición externa que afecte su activada reduce el cobre y oxida el azúcar, con
enzimática, la enzima destruyó al almidón y hidrólisis total para la prueba de IKI.
lo convierte en azúcar simple. Casi todas las
Para los tubos 7 y 8 que contienen amilasa y
enzimas intracelulares muestran actividad
almidón se obtienen resultados positivos
óptima a valores de pH entre 5 y 9. La
(tabla 2) para las pruebas de Lugol y Benedict
relación entre actividad y concentración de
(tabla 3), sin embargo, la condición de pH
ion hidrógeno refleja el equilibrio entre la
varía para ambos tubos. Para el tubo 7 el pH
desnaturalización de enzima a pH alto o bajo,
es de 2 y para el tubo 8 el pH es de 9 que enzimática de la alfa-amilasa permite
influye mostrando una coloración azul detectar anomalías en los órganos que
negruzca para IKI y amarillo claro para la producen, por ejemplo, puede
Benedict. En este sentido, los resultados ayudar para diagnosticar problemas
indican que hay una producción parcial con del páncreas como pancreatitis o
actividad disminuida y que la concentración alteraciones en la actividad de las
baja de amilasa influye en la coloración de la glándulas salivales, incluso para
prueba de Benedict. La producción parcial verificar el correcto funcionamiento
con actividad disminuida refleja el efecto pH del sistema nervioso, y que es quién
sobre la actividad enzimática que, según se encarga de su secreción. Por lo que,
(Mora, 2007) el cambio de pH interfiere con la determinación de su actividad
las atracciones electrostáticas y la estabilidad enzimática constituye un
produciendo una actividad parcial o una biomarcador de gran importancia
pérdida total. para el diagnóstico clínico.
✓ La prueba de Lugol además de
Conclusiones
identificar el polisacárido, permite
✓ La capacidad enzimática de la alfa determinar el comportamiento de la
amilasa se ve alterada por los cambios hidrólisis y la actividad enzimática
de temperatura de manera que las que puede verse afectada por el pH y
temperaturas muy bajas y muy altas la temperatura. En comparación la
inhiben su capacidad enzimática. prueba de Benedict refleja resultados
✓ Se puede concluir que un cambio en en base a los azúcares reductores
la temperatura, afecta la actividad presentes en menor o mayor
enzimática pues se altera la abundancia, a través de la reacción de
conformación de la proteína. Para que oxido-reducción (reacción redox), lo
una enzima actúe de manera eficiente que proporciona una evidencia
tiene que estar en condiciones experimental con gran relevancia.
óptimas (pH, temperatura y estar en ✓ El reactivo de Benedict es alterado
presencia de su sustrato). Como se por el pH y que en casos de pH
observo en el tubo 4 ambas pruebas extremos se da una producción
resultaron negativas pues sin el parcial con actividad enzimática
sustrato (almidón), no hay actividad disminuida; lo que podemos observar
enzimática. a simple vista notando una coloración
✓ Se pudo determinar que la enzima naranja clara.
alfa-amilasa requiere una temperatura
Bibliografía
y pH específico para realizar su
función, es decir lograr la ✓ Murray, R.; Bender, D.; Kennelly, p.;
degradación para formar azúcares Rodwell, V.; Weil, A. (2010). Harper
simples. En cuanto al pH, se debe Bioquímica ilustrada (28° ed).
contar con un pH alcalino, en un México: Ciudad de México. Mc Graw
rango entre 7 y 8, ya que, este es el pH Hill.
en la saliva y el duodeno. La ✓ Tabernilla, D., Tabernilla, R.,
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Importancia del diagnóstico de la
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alse
✓ Aguiar, C., Carrillo, F., Díaz, S., &
Parreño, J. (25 de 05 de 2014).
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Obtenido de Laboratorios de
Bioquímica:
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✓ Mora, S. (2007). Manual de
Experimentos de Laboratorio para
Bioquímica. San José: Editorial
Universidad Estatal a Distancia.
