Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas
Nieves Abril Díaz1, J. Antonio Bárcena Ruiz1,
Emilio Fernández Reyes1, Aurora Galván Cejudo1,
Jesús Jorrín Novo1, José Peinado Peinado1,
Fermín Toribio Meléndez-Valdés1, Isaac Túnez Fiñana2
RESUMEN
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de
un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas
y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer
este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de
onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la
espectrofotometría. A continuación, y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro
se harán espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta
la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las
concentraciones de distintas biomoléculas.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas
que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química
y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en
general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar
biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos específicos que
reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en
muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones,
entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones
que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura
atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo
que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de
biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto
permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la
luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado
energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se
absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados
excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a
distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de absorción- constituye una
seña de identidad de esta. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta
el estado energético fundamental.
