Curso de Ecología Microbiana
E.P. de Microbiología y Parasitología
Facultad de Ciencias Biológicas-UNMSM
Laboratorio de Ecología Microbiana
Se tienen dos comunidades de organismos, definidos por A
y B. En base a los datos proporcionados ¿Cual de las dos
comunidades será la mas diversa?
La B es la más diversa.
Diversidad de especies
Describe el conjunto de
poblaciones en una
comunidad.
Dos factores definen la
diversidad de especies:
Riqueza de las
especies(Número de
especies en la
comunidad)
Species Evenness
• Abundancia relativa de las especies.
(Cuantos individuos de una especie
dentro de una comunidad esta presente
respecto a las demás)
Riqueza de las especies
Número de especies
diferentes que se
encuentran en un
ecosistema, región o área en
particular.
Tipo más común de índice
de biodiversidad.
Nro alto, mayor riqueza.
No toma en cuenta el Nro.
de individuos, abundancia o
distribución de las mismas.
Útil en conservación de
habitats.
Uniformidad de especies
Se refiere a la abundancia relativa de cada
especie en un entorno particular.
Medida influenciada por la cantidad de
especies y tmb el número de individuos de
esas especies.
Medida de si un ecosistema particular está
dominado numéricamente por una especie o
si está representado por un número similar de
especies.
Compara el número de individuos entre
especies para producir una abundancia
relativa.
Diversidad de especies
Ambas comunidades presentan árboles, 5 especies. Pero en la A, una especie predomina. En
contraste en la B no hay predominancia.
Se dice que la especie predominante en A es muy RICA, pero no hay una buena
representatividad en esa comunidad.
Diversidad de especies
Diversidad de especies
Riqueza de las Especies:
d = S – 1/ logN
S = Número de especies
N = Número de individuos
Diversidad de especies
Índice de Diversidad de Shannon Wiener:
Es sensible:
A la riqueza y a la abundancia relativa de las
especies.
Al tamaño de la muestra; especialmente en
muestras pequeñas.
Este índice es más efectivo en comunidades
pequeñas
H’ = C/N(NlogN-ni logni)
H’ = Índice de diversidad de SW
C = 2,3
N = Número de individuos de cada
especie
ni = Número de cada especie i
Morfotipos Serotipos
Biotipos Patotipos
DIVERSIDAD
MOLECULAR
La temperatura de melting (Tm)
Tm=Temperatura a las cual el 50% de moléculas se
denaturan
Denaturar: las 2 hebras de ADN se separan.
En base a esto se pueden diferenciar los
microorganismos, dado que cada especie tiene un
Tm diferente… relacionado con el contenido G+C
Contenido de G+C
Más particular en la
diferenciación de
familias o clases.
Para caracterizar
preliminarmente a los
microbios.
Un G+C se relaciona con un mayor Tm porque el G-C es de triple enlace.
La mayoría esta entre 40 – 60%
Cinética de reasociación
Presencia de un determinado gen pero ya dentro de un genoma.
También llamada perfil COT
Cinética de reasociación
Las de copias múltiples se van a
hibridar más rápido
Cinética de reasociación
Mayor Cot, MAYOR complejidad genómica
Cinética de reasociación
Reasociación del DNA Bacteriano del Suelo
(perfil Cot).
Reasociación del ADN en E. coli
Reacción en cadena de
la polimerasa (PCR)
• Amplificación de una sola secuencia génica
• Ejemplo:
Control ambiental: detección de
coliformes en muestras de aguas, 1-5.
células viables/100ml.
Es sencilla de aplicar y replicar.
RFLP: polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción
Combinan secuencias de material genético y enzimas de restricción, que
tienen un corte determinado o particular.
RFLP: polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción
Ventajas:
Desventajas:
-Numero de marcadores -Requiere ADN de alta calidad.
ilimitados. -Sondas específicas para cada especie.
-Alta cobertura genómica. -Uso de radiactivos.
- Las sondas que se utilizan son especificas
-Alto nivel de polimorfismo.
de cada especie
RAPD: Análisis de DNA polimórfico
amplificado al azar
Se hace una amplificación aleatoria, con el uso de primers pequeñas y debido a eso
son inespecíficos.
Van a amplificar y pueden mostrar valores distintos y lo que se ven son patrones de
banda
Ventajas: Desventajas:
Universales -Muy sensible.
-Primers elegidos al azar. -Baja reproducibilidad.
-Sin necesidad de conocer el genoma de -Homoplasia: Mismo tamaño, diferente
organismos a estudiar. secuencia Poca especificidad.
-Fácil, rápido, poco laborioso. Homoplasia: secciones de ADN que
-Análisis sencillo de perfiles. presentan el mismo tamaño
AFLP: Polimorfismo en la longitud de
fragmentos amplificados
Combina las 2 técnicas
anteriores.
Se incrementa la especificidad y
la sensisbilidad
Ventajas: Desventajas:
-Robusto: Fragmentos largos, alta -Laborioso.
especificidad. -Costo medio/elevado.
-Uso amplio de diversas enzimas -Interpretación compleja. Dado
no limitadas a la especie. que son más grandes
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
Es un método de electroforesis en gel que
separa genes que tienen el mismo tamaño y
pero que difieren en sus secuencia.
Los productos de PCR de la misma longitud
pero con secuencias diferentes pueden ser
separados en geles en gradiente de acuerdo al
comportamiento del “melting” del DNA.
Las distintas bandas observadas en el gel DGGE
son formas diferentes de un mismo gen.
Se empleo en un inicio pa discernir entre
especies en base a un solo gen.
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
(-)
(+)
Con sustancias denaturantes, algunas sustancias son resistentes y se
van a permanecer, pero si no, se deshorquilla y se le complica
migrar
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
Las concentraciones desnaturalizantes
crecientes abren la doble hebra del
DNA en distintos dominios.
Cuando la temperatura de
desnaturalización (Tm) del dominio
más lento se alcanzó, el DNA estará
parcialmente desapareado, creando
moléculas ramificadas con una
movilidad reducida en el gel de
poliacrilamida.
El medio ambiente desnaturalizante
es creado por una temperatura de
corrida uniforme entre 50 y 60 oC y
una gradiente desnaturalizante lineal
formada con urea y formamida.
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
(-)
Bajo
DGGE : Denaturante
TGGE : Temperatura
(+)
Alto
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
Extracción de Preparación del Gel
DNA
Purificación de Carga de las muestras
DNA
Amplificación por Electroforesis
PCR
Teñido
A diferencia de la normal, se
cambia la gradiente y corriente Procedimiento
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
BIO-RAD
Casting strand Gradient former
Sandwich Core Electrophoresis
Tank
Electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE)
El operón ribosómico
A) Representación esquemática del operón, donde se muestran los genes
estructurales de los tres tipos de ARNr (rrs, rrl y rrf), los promotores P1
y P2 y las regiones intergénicas (IG).
B) Estrategia de amplificación del gen rrs (ADNr 16S).
C) Visualización
El ARNr 16S
Se utiliza por su amplia
replicabilidad.
Es grande tmb.
Y dado que es grande exiten
regiones variables, es ahí donde
se realizan los análisis pa ver si
son de es especies distintas
Análisis de la biodiversidad de las comunidades
microbianas
Comunidad
Microbiana
Extracción de DNA
DNA total de la Comunidad
PCR
Amplificación de los genes
rRNA 16S usando primers Muestras
universales o específicos 1 2 3 4
Diferentes
genes rRNA
Excindir las bandas y 16S
DGGE
clonar los genes rRNA 16S
Excindir las
bandas
Secuenciamiento Secuenciamiento
Diversidad bacteriana
Hay mas
diferencia
genética entre
Bacillus y E. coli
que entre un
Paramecio y el
ser humano
Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA genes to
Acidithiobacillus isolated from Peru (in bold). The scale bar indicates 0.01
inferred nucleotide substitutions per site.
Primer vistazo: Secuenciamiento de
Sanger
No se puede secuenciar todo un genoma de
una, se tiene que hacer por pedacitos.
Actualmente se utiliza pa saber la
secuencia de un gen en específico.
Cambia a los nucleótidos a
didesoxinucleotidos y de ahí se procede
con sanger
Primer vistazo: Secuenciamiento de
Sanger
Electroforesis
capilar
Next-Generation sequencing (NGS):
Illumina
Secuenciamiento de 2da
generación
Metagenómica
Se define como el estudio del
material genético, el cual es
obtenido directamente de
muestras ambientales.
Una colección de genes
secuenciados del ambiente pueden
ser analizados de manera análoga
al estudio de un genoma simple.
La aplicación de esta técnica de
estudio de comunidades de
microorganismos directamente en
sus ambientes naturales, evitando
la necesidad del aislamiento y
cultivo en el laboratorio de
especies individuales.
Observación de
Leeuwenhoek: Microscopía microorganismos
heterótrofos, autótrofos y
parásitos
M.O no cultivables
Koch: Medios de cultivo
M.O cultivables
Bergey: Ningún M.O puede
clasificarse sin ser cultivado
Cultivos puros
“Anomalía del recuento en Recuento en placa ≠ Examen
placa” microscópico
METAGENÓMICA
99.8% no
¿Quién esta ahí?
cultivable
¿Qué están haciendo?
Metagenómica
Isolation of bacterial
DNA from fecal samples
DNA sequencing, assembly, and gene prediction
Shotgun libraries were constructed from
randomly sheared bacterial DNA (2-3 kb)
(HydroShear, GeneMachines) and the pUC18
vector .
Template DNA for the sequencing was prepared by
polymerase chain reaction (PCR) amplification of the
insert DNA using a TaKaRa ExTaq kit (Takara Bio) and
GeneAmp PCR System 9700 (ABI).
DNA Research 2007 14(4):169-181
Comparative Metagenomics
Revealed Commonly Enriched
Gene Sets in Human Gut
Microbiomes
Results
Compare the overall sequence similarities among the
microbiomes from fecal and other-environmental
samples.
The data indicated that all gut microbiomes from the
adults and weaned children form a distinct group in
contrast, those from the unweaned infants were highly
divergent from each other and from the microbiomes of
the adults and children, as well as from those of other
environments.
Comparative Metagenomics
Revealed Commonly Enriched Gene
Sets in Human Gut Microbiomes
17-43% of the predicted genes could be assigned to
particular genera (35-65 genera, 121 in total) in the
adults and children (Fig. 2).
A significantly higher proportion of genes (35-55%)
was assignable (31-61 genera, 84 in total) in the
unweaned infants, but, overall, the data indicated
thatthe majority of gut microbes are as yet
uncharacterized.
Detected a total of 142 genera from the 13 samples
in this analysis.
Compositional view of human
intestinal microbiomes
