UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 6

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
CREATININA

Integrantes:

1. Crispin Castellanos, Kevin Arnold (20161101)

2. Lliuyacc Romani, Jesenia (20141095)

3. Mollyk Montes, Anwar Rael (20151447)

4. Sánchez Chávez, Marcos Moisés (20161118)

5. Uribe Ventura, Ricardo Ernesto (20151375)

Grupo: A* (martes/11am a 1pm)

Fecha de la práctica: 17 de octubre del 2017
Fecha de entrega de informe: 24 de octubre del 2017

2017-II
 INTRODUCCIÓN

La creatinina se produce de forma endógena a partir de la creatina y el

creatinfosfato como resultado de los procesos metabólicos musculares. Se elimina por
riñón mediante filtración glomerular. La determinación de la creatinina en suero sirve
para el diagnóstico y el control de enfermedades renales agudas y crónicas así como
para la estimación del filtrado glomerular. La concentración de creatinina en orina
puede emplearse como una magnitud de referencia de la excreción de analitos (Perazzi
& Angerosa, 2011).

Se han descripto numerosos métodos de determinación de creatinina, tales como

la prueba de Jaffé con picrato alcalino en sus diferentes modificaciones y la
determinación enzimática. Para nuestro caso solo utilizamos el método colorimétrico.

Los métodos colorimétricos se basan en la reacción de Jaffé, que data del año
1886. La creatinina reacciona con el ácido pícrico en medio alcalino formando un
complejo de color rojo a una longitud de onda entre 510- 520 nm. La intensidad del
color formado es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra ensayada
(Murray, 1984). 

La creatinina no es la única que reacciona, por eso es que tiene baja

especificidad. Existen interferentes positivos, entre ellos las proteínas, glucosa,
acetoacetato, ácido ascórbico y ácido úrico, e interferentes negativos, y de ellos el más
importante es la bilirrubina. Por ello la desproteinización es útil para eliminar la
interferencia por proteínas, utilizando como desproteinizante el ácido tricloroacético
(TCA) al 10%, u otros como el ácido fosfotúngstico. El uso de desproteinizantes es de
larga data, y se utilizó en el antiguo método de referencia, el método de Owen et al
(1954). Con el método de punto final, aun incorporando la desproteinización, no se
eliminan los otros interferentes positivos, ni los negativos (Perazzi & Angerosa, 2011).
 RESULTADOS

MESA 1:
TUBO TUBO TUBO
BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA
Agua destilada 3ml - -

Sol. Estándar de - 3ml -

creatinina
Muestra clarificada - - 3ml
(filtrado)
Sol. Picrato de 1.5ml 1.5ml 1.5ml
sodio
Absorbancia 0.060 0.202 0.132
óp.=520nm
Absorbancia - 0.142 0.072
corregida

GRUPAL:
TUBO BLANCO TUBO TUBO
ESTÁNDAR MUESTRA
M1 - 0.142 0.072

M2 - 0.128 0.042

M3 - 0.143 0.062

M4 - 0.023 0.056

M5 - 0.191 0.078

M6 - 0.128 0.039

Concentración de creatinina en sangre

Cst= 0.004 mg/ml
Cm= Cst x Am = 0.004 x 0.072 = 0.002 mg/ml
Ast 0.142
0.002mg 1ml
0.009mg 4.5ml 3ml filt.
0.06mg 20ml filt. 2ml
0.03 mg 1ml

C creatinina (mg/ml)= 0.002 C creatinina en sangre (mg/ml)= 0.03

DISCUSIONES

CREATININA

La creatinina es un derivado de la creatinina fosfato, es una biomolécula no

tóxica sin ninguna importancia metabólica. Su filtración en la sangre es realizada por los
riñones sin producirse una reabsorción de esta. El análisis de los niveles de creatina en
sangre u orina es utilizado por los médicos para encontrar algún problema renal a partir
de la tasa de filtración glomerular (GFH) (Zamora et al, 2007).

Para poder calcular la concentración de creatinina en sangre a partir de un

método espectrofotométrico se debe de colorear la muestra a un tono que permita
calcular mediante el haz de luz la absorbancia. Para lograr esto lo primero que se realizó
en la práctica fue la desproteinización de la muestra por el factor desproteinizador
tungstato de sodio.

Una vez que la muestra quede incolora se busca colorearla, para este caso en
particular la reacción utilizada se denomina reacción de Jeff. Esta consiste en añadir
picrato de sodio formando el ácido picrámico el cual se procederá a agitar en el vórtex
para luego esperar 20 minutos hasta que se pueda medir la absorbancia de la muestra
formando una muestra de color rojo-naranja.
 FIGURA 1: Espectro de absorbancia de creatinina picrato (B) y
solución de picrato en agua (A)
FUENTE: Owen et al. (1954)

Se puede observar en la Figura 1 que en la longitud de onda de 490 se puede

llegar a la máxima absorbancia, sin embargo, para longitudes de onda menores a 500 la
absorbancia de la solución A también es muy alta por lo que se busca longitudes de
onda en las que la solución A sea la mínima. Las longitudes de onda normalmente
utilizadas son mayores a 500 nanómetros, en este caso se utilizará la de 520mµ (Owen
et al, 1954).

Al utilizar esta longitud de onda encontramos la siguiente concentración de

creatinina en la muestra siguiendo los cálculos anteriores:

C creatinina en sangre (mg/ml) = 0.03

En la Tabla 1 se puede apreciar la composición de la sangre de un ganado

normal en distintas etapas de vida, la cantidad de creatinina en sangre de esta gamma de
animales esta de 4.54 a 3.41 mg/cc. La concentración hallada es lejana a este rengo por
lo que podemos afirmar que la muestra de sangre no pertenece a la de un vacuno.
 TABLA 1: Composición de sangre de un ganado normal

Fuente: Anderson & Pratt

GENERALIDADES DE LA SANGRE BOVINA

La sangre es un líquido de color rojo escarlata, localizado en el sistema

circulatorio del organismo animal. Es un producto que se obtiene después del sacrificio
de las reses, la cual se considera apta para consumo humano una vez se somete
previamente a un tratamiento.

Composición química de la sangre:

Belitz & Grosch (1997), menciona que “la sangre está formada por el plasma,
que es un componente rico en proteínas, en el que están suspendidos los elementos
celulares como eritrocitos, leucocitos y trombocitos.
 En el plasma se encuentran además de las sales sanguíneas (fosfato potásico,
cloruro sódico y pocas sales de Ca, Mg y Fe), una gran cantidad de proteínas, entre las
que se destaca la albúmina, diversas globulinas y el fibrinogeno”.

Belitz & Grosch (1997) anuncia que los compuestos nitrogenados de bajo peso
molecular de la sangre son principalmente urea y en menor concentración aminoácidos,
ácido úrico, creatina y creatinina. En la Tabla 2 se observa la composición química de la
sangre, en donde los mayores porcentajes están representados por agua y proteínas.

TABLA 2: Composición química aproximada de sangre (g/100 g

porción comestible)

FUENTE: Belitz & Grosch (1997)

Algunas características físicas que presenta la sangre de bovino:

Color. Tanto la mioglobina como la hemoglobina son proteínas conjugadas y

son las responsables del color rojo característico en la sangre, que con la exposición a la
atmósfera se torna más oscuro.

Peso específico y viscosidad relativa. A continuación, en la Tabla 3 se presentan

los datos correspondientes de la sangre de ganado vacuno.

TABLA 3: Peso específico y viscosidad relativa de la sangre de ganado vacuno

FUENTE: Divakaran (1983)

 CONCLUSIONES

 Se logró satisfactoriamente la cuantificación de la creatinina a través del método

espectrofotométrico de colorimetría utilizando la teoría y aplicación de las Leyes
de Lambert y Beer, empleando el método de factor de calibración

 Calculamos la concentración de la creatinina en la sangre (muestra), a través del

uso de factor de calibración, volviéndolo útil para futuras determinaciones de
concentraciones.

CUESTIONARIO

1. Una suspensión aislada de E.Coli da una absorbancia de 0,793 a 260 nm en

una celda de 1 cm a pH 4,5. Si el E11 %cm es 197, calcular la concentración en
mg/mL.

Datos:

A= 0,793

E11 %cm= 197 = Absorbancia específica de 1%(p/v) en una celda de 1 cm

A
E11 %cm =
%C∗b

0,793
197= → % C=0,00403
%C x 1

Calculando la concentración:

0,00403 g_______100ml

0,0000403g______1 ml
 g 1000 mg mg
0,0000403 x =0,0403
ml 1g ml

2. Calcule el coeficiente de extinción molar a 361nm para la acuocobalamina en

tampón fosfato 0.1M a pH 7,0 a partir de los siguientes datos obtenidos en una
celda de 1cm.

SOLUCIÓN CONC. X 10-5 M Io I

A 2.23 93.1 27.4
B 1.90 94.2 32.8

Nota. - Halle el coeficiente de extinción molar para cada solución y luego el

promedio de estos valores.

AA= log (Io/I) =log (93,1/27,4)

AA =0,534

A A =abc

0,534=a1x1x2, 23(10-5) → a1= 23 946,188 cm-1 M-1

AB= log (94,2/32,8) =0,458

AB= abc

0,458 =a2x1x 1,9(10-5) →a2= 24 105, 263 cm-1 M-1

3. En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes resultados:

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

Transmitancia % 92,9 89,9 86,3 84,3 81,3 78,7 73,8 70,5

Hallar el factor de calibración promedio y la conc. De dos muestras de suero que

resultaron con transmitancia de 88,3 y 85,1.
Absorbancia 0,032 0,0462 0,064 0,074 0,09 0,1040 0,132 0,152
A= 2-logT

Hallando los factores de calibración, respectivamente:

Fc1 = 0.50 mg/ 0.032 = 15.625 mg

Fc2 = 0.75 mg/ 0.046 = 16.304 mg

Fc3 = 1.00 mg/ 0.064 = 15.625 mg

Fc4 = 1.25 mg/ 0.074 = 16.892 mg

Fc5 = 1.50 mg/ 0.090 = 16.667 mg

Fc6 = 1.75 mg/ 0.104 = 16.827 mg

Fc7 = 2.00 mg/ 0.132 = 15.152 mg

Fc8 = 2.50 mg/ 0.152 = 16.447 mg

Fc 1+ Fc 2+ Fc 3+ Fc 4+ Fc 5+ Fc 6+ Fc 7+ Fc 8
̅̅ xFc= = 16.0565
8

Cálculo de la concentración:

Amp = 2 - T%

Amp1 = 0.054

Amp2 = 0.070

Cmp = Fc x Amp

Cmp1 = 16.0565 x 0.0540 = 0.8611 mg/mL

Cmp2 = 16.0565 x 0.0700 = 1.1239 mg/mL

4. Para evaluar un metabolito “X”, una muestra fue sometida a dilución
tomando una parte de ella con 4 partes de agua y luego fue comparada
espectrofotométricamente con un estándar de 10 mg/ML obteniéndose las
siguientes lecturas de absorbancias: Blanco = 0.023,estandar 0.357 ,y
muestra 0.677.Calcule la concentración de muestra en mg%.

Ablanco = 0.023

AST  = 0.357

AM = 0.677

[st] = 10 mg/mL

[M] = 0.25 mg / mL

Ast corregido = Ast - Ablanco = 0.357 - 0.023 = 0.334

Amp corregido = Amp - Ablanco = 0.677 - 0.023 = 0.654

Volumen = 0.2

Cmp = Cst x Amp /Ast = 10 mg/mL x (0.654/0.334) = 19.5808 mg/mL

5. ¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo.

El factor de dilución se puede definir como el número de veces que una

disolución es más diluida que otra y se calcula dividiendo la concentración de la
disolución más concentrada por la más diluida.

Para una dilución de ½, el factor de dilución es 2/1 ó 2. Para una dilución de

1/10, el factor de dilución es 10/1 ó 10 ó 101. Para una dilución de 1/1.000.000 o
10-6, el factor de dilución es 1.000.000/1 ó 1.000.000 ó 106.
Cuando se realiza por ejemplo un recuento de bacterias aerobias mesófilas, el
factor de dilución indica el número por el cual hay que multiplicar el número de
bacterias encontradas en las placas, para conocer cuánto hay en 1 mL original de
la suspensión bacteriana.
6. ¿Qué es el factor de calibración? Explique mediante un ejemplo.

El proceso de calibración se basa en la medida de una serie de fuentes de

referencia previamente calibradas y la comparación con los resultados indicados
por el activímetro con los valores de actividad certificados. Su objetivo es la
determinación del factor de calibración f, definido como: f=A/Ai

A: valor de referencia para la actividad de la fuente.

Ai: Valor neto indicado por el activímetro (=lectura – fondo)

7. Explique la preparación de la muestra problema (sangre) para la

determinación de creatinina.

Se realizó la desproteinización por el método de Folin-Wu. Para esto, se

colocaron 2 mL de sangre exaltada (con anticoagulante) en un tubo de prueba de
50 mL. Se le adicionó 14 mL de agua destilada y 2 mL de tungstato 10% y luego
se agitó el tubo después de cada adición.

Posteriormente se agregó a la solución H2SO4 y se agitó nuevamente. Se observó

un precipitado de color marrón chocolate. Luego se filtró a través de un papel
filtro rápido. La muestra del líquido filtrado era incolora.

Por último, se llevó a cabo la reacción de JAFFÉ para determinar la

concentración de creatinina en la muestra de sangre.

8. Diferencias entre una solución stock, solución estándar y solución trabajo.

La solución stock composiciones concentradas de nutrientes las cuales están

formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido
al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se
emplean a muy bajas concentraciones, a diferencia de la solución estándar que es
una disolución que contiene una concentración conocida de
un elemento o sustancia específica, llamada Z soluciones, como las disoluciones
 valorantes y mientras que la solución trabajo es la solución de procesado diluida
a la concentración a la que ha de utilizarse.

9. ¿Qué función bioquímica cumple la creatinina? Escriba su fórmula.

Sirve como parámetro bioquímico de la función renal. En principio, cuanto

mayor es el descenso de la función renal, tanto más elevado es el valor de la
creatinina.
Fórmula de la creatinina: C4H7N3O

10. ¿Qué papel cumplen los siguientes reactivos en la cuantificación de

creatinina? Tungstato de sodio | Ácido sulfúrico | Ácido pícrico

El tungstato de sodio reacciona con el ácido sulfurico para formar el ácido

tungstico que desproteiniza la proteina desnaturalizando y precipitando por
cambio brusco de pH.
El ácido pícrico es el reactivo que da la coloracion a las soluciones.

11. El coeficiente de extinción molar de un complejo yodo- glucógeno a450 nm

es 0,20. Calcule la concentración del glucógeno en una solución de complejo
en yodo que tiene una absorbancia de 0,36, medida en una cubeta de 3 cm.

A = a.b.c
0,36 = 0,20.3.c
c = 0,6 M
 BIBLIOGRAFÍA

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Pennsylvania, 336-348.
 Belitz, HD y Grosch, W. Química de los alimentos. 2ª edición. Zaragoza
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FAO. No. 32. Roma. 1983.
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Creatinine in Plasma or Serum, and in Urine a Critical Examination.

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