Tinciones Diferenciales
Prácticas de Laboratorio II
Dr. José Magariños
Téc. Luciano Rey
Téc. Belén Manrique
Tinciones diferenciales
Como su nombre lo indica, nos permiten
diferenciar entre grupos de bacterias que tienen
distintas propiedades tintoriales
Las tinciones diferenciales más comúnmente
utilizadas son la tinción de Gram y la tinción
de Ziehl-Neelsen
Tinción de Gram
• La tinción de Gram. Fue desarrollada empíricamente por
Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo
transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno
de los primeros pasos que se realiza para cualquier
identificación bacteriana.
• La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos
de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas.
Fundamento de la Técnica
La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram
negativas se establece en la naturaleza y características de la
pared celular bacteriana.
Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de
peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-
mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloración con alcohol
acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se
reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior
de la célula.
Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de
peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-
mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fácilmente teñida por
el colorante secundario o de contraste.
Resultados de la coloración
Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se refiere
difieren en el color con el que finalmente se tiñen las bacterias.
Gram positivas se observarán de azul por el cristal violeta y no
perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las
bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial con los
siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la Safranina.
La diferencia esta determinada por la composición de su envoltura
celular, las bacterias Gram. positivas poseen una malla de péptido
glicano en su parte mas externa ,mientras que las Gram. negativas
recubriendo una fina capa de peptidoglicano y presentan una
membrana externa .
Reactivos y Colorantes
La tinción de Gram. requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Un colorante básico (+) que en contacto con
las células cargadas negativamente, reacciona con ellas
coloreándolas. El mas utilizado es el cristal violeta.
2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad
entre el colorante y las células. Los mordientes usados suelen ser
sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida
de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico; por ejemplo
alcohol acetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color
que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina.
Procedimiento Técnico
1) Realizar el extendido de la muestra
2) Fijación del extendido
Métodos físicos: acción del calor
Métodos químicos: metanol
3) Primer colorante: cristal violeta
4) Mordiente: Lugol (sc I2/KI)
5) Decoloración: mezcla alcohol-acetona 1:1
6) Segundo colorante: safranina
Procedimiento Técnico
Diferencias entre Gram (+) y (-)
Morfología Bacteriana
Tinción de Ziehl-Neelsen
• La tinción de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por
Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los
bacilos causantes de tuberculosois en muestras clínicas
de pacientes es otra muy importante tinción diferencial.
• La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos
de eubacterias: BAAR positivas y BAAR negativas.
BAAR: bacilos ácido alcohol resistentes
Fundamento de la Técnica
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. contienen
ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos
de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con
colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M.
marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para
que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una
nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante
ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento
aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual
también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que
resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de
color azul.
Procedimiento Técnico
1) Hacer un frotis
2) Secar al aire y fijar por calor
3) Cubrir todo el porta-objetos con fucsina fenicada
4) Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores.
5) El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario.
6) Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos.
7) Lavar con un chorro suave de agua.
8) Decolorar con alcohol ácido
9) Lavar con agua
10) Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto.
11) Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al microscopio
con el objetivo de inmersión
Las bacterias ZN+ o BAAR se observarán teñidas intensamente de
color rojo.
Mycobacterium tuberculosis
Tinciones Selectivas
• Las tinciones selectivas nos permiten observar
estructuras de las células gracias a su mayor
afinidad por los colorantes utilizados
• Se pueden observar estructuras como la pared
celular, cápsula, flagelos, material nuclear, e
inclusiones como depósitos de materiales de
reserva de poli-ß-hidroxibutirato, glucógeno y
gránulos metacromáticos
Coloración de esporas
Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia
denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones
ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el
microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de
calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales
vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a
generarse formas vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son
impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una
tinción, se observan al microscopio como cuerpos altamente
refringentes y sin teñir. Sin embargo, las endosporas se pueden
teñir aplicando calor a la preparación previamente cubierta con una
solución de colorante que en la técnica de Shaeffer y Fulton es el
verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de
las células vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste
permitirá distinguir claramente a las esporas de color verde.
Endosporas en las bacterias
Coloración de la cápsula
Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared
denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No
es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que
bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo
genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la
presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las
bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia
de los microorganismos.
La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el
fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de
vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los
microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su
realización es sencillísima, consiste en colocar la muestra húmeda
sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre
toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio
se observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin
color.
Procedimiento Técnico
Método de la tinta china para cápsula
1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra
de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se
mezcla suavemente sin extender.
2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y se presiona
suavemente evitando que queden burbujas.
3.-Observar inmediatamente al microscopio.
4.-Desechar la preparación en un recipiente con antiséptico.
La cápsula se observa como una gran estructura alrededor de la
célula delimitada por los pequeños fragmentos de carbón de la tinta
china.
Cápsulas bacterianas
