Rekombinantna DNK

Rekombinantna DNK (rDNK) ima molekule koje su nastale primjenom laboratorijskih metoda genetičke rekombinacije (kao što je molekulsko kloniranje) koje omogućavaju da se prikupi genetički materijal iz više izvora, stvarajući sekvence koje se inače ne bi mogle naći u biološkim organizmima. Rekombinantna DNK je je moguća zato što molekule DNK svih organizama imaju istu hemijsku strukturu. Oni se razlikuju samo u sekvencama nukleotida]] u identičnoj ukupnoj strukturi gradivnih elemenata (nukleotida).

Dijagram ligirajuće DNK. Ovaj niz nukleotida pripada genu za ljudski hemoglobin.

Polazišta

Rekombinantna DNK je generalni naziv za uzimanje komada jedne molekule DNK i njegovo kombiniranje s nekim drugom lancem DNK. Rekombinantne molekule DNK se ponekad nazivaju i himerna DNK, jer su obično izrgađene od materijala iz dvije različita vrste, poput mitskih himera. Tehnologija r-DNK koristi palindromne sekvence i dovodi do proizvodnje njihovih ljepljivih i tupih krajeva. Aekvence DNK koje se koristi u izgradnji rekombinantnih molekula DNK može poticati iz bilo koje vrste. Na primjer, DNK biljaka se može ugraditi u bakterijsku DNK ili ljudska DNK može biti spojena sa gljivičnom DNK. Osim toga, DNK sekvence koje se ne pojavljuju nigdje u prirodi mogu biti kreirane putem hemijske sinteze DNK i inkorporirane u rekombinantne molekule. Koristeći tehnologije rekombinantne DNK i sintetičke DNK, doslovno se može kreirati bilo koja sekvenca DNK i uvesti u vrlo širok spektar živih organizama.

Proteini koji mogu rezultirati iz ispoljavanja rekombinantne DNK u okviru žive ćelije, nazivaju se rekombinantnim proteinima. Međutim, kada je rekombinantna DNK koja kodira protein unesena u organizam domaćina, to ne znači da će se nužno ne proizvoditi rekombinantni protein. Tada ispoljavanje stranih proteina zahtijeva korištenje specijaliziranih modifikacija za ispoljavanje vektora, a često i značajne restrukcije stranih kodirajućih sekvenci.

Rekombinantna DNK se razlikuje od genetičke rekombinacije po tome što je rezultat vještačkih metoda u epruveti, a druga je normalan biološki proces koji rezultira u remiksu postojećih DNK sekvenci u suštini u svim organizmima.

Kreiranje rekombinantne DNK

U kreiranju rekombinantne DNK primjenjuju se posebne metode odgovarajućeg laboratorijskog procesa.^[1] Formiranje rekombinantne DNA zahtijeva vektor za kloniranje – DNK molekula koja se replicira unutar žive ćelije. Vektori su uglavnom izvedeni iz plazmid[a ili virusa, a predstavljaju relativno male segmente DNK koji sadrže potrebne genetičke signale za replikaciju, kao i dodatne elemente radi lakšeg umetanja u stranu DNK, identifikaciju ćelije koje sadrže rekombinantne DNK, i, gdje je to moguće, ispoljavanje strane DNK. Izbor vektora za kloniranja molekula ovisi o izboru organizma domaćina, veličine DNK koji se klonira o tome i da li i na koji način se ispoljava strana DNK. Segmenti DNK se mogu kombinirati koristeći razne metode, kao što su kloniranje pomoću restrikcijskih enzimia/ ligaza ili Gibsonovim sklopom.

U standardnom protokolu kloniranja, kloniranje DNK fragmenata u osnovi uključuje sedam koraka:

(1) Izbor domaćina organizma i vektora za kloniranje;
(2) Priprema vektora DNK;
(3) Priprema DNK za kloniranje;
(4) Kreiranje rekombinantne DNK;
(5) Uvođenje rekombinantne DNK u organizam domaćina;
(6) Izbor organizama koji sadrže rekombinantnu DNK, i
(7) Pregled i izbor (skrining) klonova sa željenim DNK umecima i biološkim svojstvom.^[2]^[3]^[3]^[4]

Ekspresija rekombinantne DNK

Nakon transplantacije u organizam domaćina, sadržana strana DNK u rekombinantnom DNK konstruktu može ali ne mora biti ispoljena. To je zato što DNK može jednostavno biti replicirana bez ekspresije ili može biti transkribirana i prevedena, tako da se proizvodi rekombinantni protein]]. Općenito govoreći, izraz stranog gena zahtijeva restrukturiranje gena uključene sekvence, što je potrebno za proizvodnju jedne iRNK molekule koja se može koristiti u ćeliji domaćinskom translacijskom aparatu (npr. promotoru, pokretanju translacijskog signala i transkripcijskog terminatora). Specifični promjene u organizmu domaćina mogu poboljšati ekspresiju unesenog gena. Osim toga, prilagodbe mogu biti potrebne i za kodirajuće sekvence kao i za optimizaciju translacije , čineći protein rastvorljivim. Usmjeravanjem rekombinantnog proteina pravilno u ćeliji ili vanćelijskoj lokaciji, stabiliziraju protein da se spriječi degradacija.

Osobenosti organizama sa rekombinantnom DNK

U većini slučajeva, organizmi koji sadrže rekombinantnu DNK imaju normalne fenotipove. To se odnosi na njihov izgled, ponašanje] i metabolizam, koji su obično nepromijenjeni, a jedini način da se pokaže prisustvo rekombinantne sekvence je da se ispita sama DNK, obično koristeći polimeraznu lančanu reakciju (PCR test.

Ako je u rDNK sekvenci kodirajući gen koji se izražava, onda se prisustvo RNK i / ili proteinskog proizvoda rekombinantnog gena mogu otkriti, obično pomoću RTPCR ili Western blot metodom hibridizacijezapadne hibridizacije. Ukupne fenotipske promjene nisu norma, osim ako izabrana i modificirani rekombinantni gen unesen da se generira biološka aktivnost u organizmu domaćina. Dodatni fenotipovi koji se pojeve, uključuju toksičnost na organizam domaćina uzrokovanu proizvodom rekombinantnog gena, posebno ako je proteinska ekspresija prekomjerno izražena u neodgovarajućjm ćelijama ili tkivima.

U nekim slučajevima, rekombinantna DNK može imati pogubne efekte čak i ako nije izražena. Jedan mehanizam koji dovodi do te pojave se to dogodi je insercijska inaktivacija, u kojoj je rDNK umetnuta u gen ćelije domaćina. U nekim slučajevima, istraživači koristite ovaj fenomen za "nokaut" gena da odrede njihovu biološku funkciju i značaj. Drugi mehanizam kojim umetnuta rDNA hromosomsku DNK može uticati na ekspresije gena je za neprikladna aktivacija prethodno neispoljenih gena ćelije domaćina. To se može dogoditi, na primjer, kada se fragment rekombinantne DNK koji sadrži aktivni promotor nalazi pored prethodno "tihog" gena ćelije domaćina ili kada gen ćelije domaćina svojom funkcijom obuzda ekspresiju gena outem insercijske inaktivacije rekombinantne DNK.

Primjena tehnologije rekombinantne DNK

Rekombinantna DNK se naširoko koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanjima. Danas, rekombinantni proteina i drugi proizvodi koji su rezultat upotrebe tehnologije rDNA se nalaze u suštini, u svakoj zapadnoj apoteci, ljekarskom ili veterinarskom uredu, medicinskim laboratorijama za ispitivanje i biološka istraživanja. Osim toga, organizmi koji su izmanipulisani korištenjem tehnologije rekombinantne DNK, kao i proizvodi dobijeni iz tih organizama, pronašli u svoj put u mnogim farmama, supermarketima, medicinskim ormarima pa čak i prodavnicama životinja, kao što su one koje se bave prodajom GloFish i drugim genetički modificiranih sorti i varijeteta.

Najčešća primjena rekombinantne DNK je u osnovnim istraživanjima, u kojimam je ta tehnologija važna za većinu dosadašnjih aktivnosti u biološkim i biomedicinskim naukama. Rekombinantna DNK se koristi i za identifikaciju, mapiranje i sekvenciranje gena, kao utvrđivanje njihova funkcija. Sonde rDNK se upotrebljavaju u analizi ekspresije gena unutar pojedinih ćelija i širom tkiva cijelog organizma. Rekombinantni proteini su široko koriste kao reagensi u laboratorijskim eksperimentima i za generiranje sonde antitijela za ispitivanje sinteze proteina u ćeliji i organizamu.

Mnoge dodatne praktične primjene rekombinantne DNK mogu se naći u industriji, proizvodnji hrane, humanoj i veterinarskoj medicini, poljoprivredi, i bioinžinjerstvu. U nastavku su identificirani neki specifični primjeri.

Rekombinantni himozin: Pronađen u sirilu, himozin je enzim potreban za proizvodnju sira. To je bio prvi genetički modificirani prehrambeni aditiv koji se koristi u komercijalne svrhe. Tradicionalno, hymozin je dobijan iz sirila, koje je vađeno iz četvrtog želuca mlijekom hranjenih teladi. Naučnici su kreirali nepatogeni soj (K-12) za bakterije Escherichia coli, za laboratorijsku proizvodnju velikih količina enzima. Ovaj mikrobiološki proizvod rekombinantnog enzima, strukturno je identičan sa telećim, troškovi su neuporedivo manji, pa se proizvodi u ogromnim količinama. Danas je oko 60% od tvrdog sira u USA napravljeno upotrebom rekombinantnog himozina. Od 1990. godine, nadležna agencija za hranu i lijekove (FDA) je odobrila ovakav himozin deklaracijom "općenito priznato kao sigurno" (GRAS), na osnovu podataka koji pokazuju da je enzim bio siguran.^[5]
Rekombinantni ljudski insulin: gotovo u potpunosti je zamijenio inzulin dobijen iz životinjskih izvora (npr svinja i goveda), za liječenje insulinske zavisni dijabetes. Rekombinantne insulin je sintetiziran umetanjem ljudskog inzulinskog gena ljudskog u Escherichia coli ili kvasac (Saccharomyces cerevisiae koji onda proizvode inzulin za ljudsku upotrebu.^[6]
Rekombinantni ljudski hormon rasta (HGH, somatotropin): potreban je pacijentima čija žlijezda hipofiza stvara nedovoljne količine hormona za podršku normalnog rasta i razvoja. Prije nego što je postao dostupan rekombinantni HGH, za terapeutsku upotrebu je dobijan iz hipofize žlijezda leševa. Ova nesigurna praksa je, kod pacijenata u razvoju, dovela do pojave Creutzfeldt-Jakobove bolesti. Rekombinantni HGH eliminira ovaj problem, a danas se masovno koristi u terapeutske svrhe. Također je zloupotrebljen i kao stimulirajuća droga za poboljšanje spremnosti sportista i drugih osoba.
Rekombinantni faktor zgrušavanja krvi, faktor VIII: A protrin zgrušavanja krvi koji se daje pacijentima s oblicima poremećaja krvarenja, kao što je hemofilija. Oni nisu u stanju da proizvedu faktor VIII u količinama koje omogućavaju normalno zgrušavanje krvi. Prije razvoj rekombinantnog faktora VIII, protein je dobijen obradom velikih količina ljudske krvi iz više donatora, koja je imala vrlo visok rizik od prijenosa krvno prenosivih zaraznih bolesti, na primjer HIV-a i hepatitisa B.^[7]
Rekombinantne vakcine protiv hepatitisa B: infekcija hepatitisa B]] je pod kontrolom, zahvaljujući upotrebi rekombinantne vakcine, koji sadrži oblik virusa hepatitisa B sa površinskim antigenom koji se proizvodi u ćelijama kvasca. Razvoj rekombinantne podjedinice vakcina je važan i neophodan za razvoj, jer virus hepatitisa B, za razliku od drugih zajedničkih virusa, kao što su polio virus, ne mpže da se uzgaja in vitro.^[8]
Dijagnoza infekcije HIV-om: svaka od tri naširoko korištene metode za dijagnosticiranje infekcije HIV-om je razvijena pomoću rekombinantne DNK. Test antitijela (ELISA ili Western blot) koriste se rekombinantnim HIV-proteinom za testiranje na prisustvo antitijela koje tijelo proizvodi kao odgovor na infekciju HIV-om. Test DNK traži prisustvo HIV genetičkog materijala pomoću obrnute reakcije polimerazne transkripcije lanca (RT-PCR). Razvoj RT-PCR testa je omogućio kloniranje i molekulski redoslijed u analizi genoma HIV.^[9]
Zlatna riža: . Razne rekombinantne riže su konstruirana tako da imaju ekspresiju enzima, odgovornih za biosintezu β-karotena. Obećavaju značajno smanjenje učestalosti nedostatka vitamina A u svjetskoj populaciji. Zlatna riža riže trenutno nije u upotrebi, dok se ne riješe regulatorna pitanja njenih svojstava.
Usjevi otporni na herbicide: oficijelne sorte važnih poljoprivrednih kultura (uključujući i soju, kukuruza sirak, uljanu repicu, lucerku i pamuk) su razvijene u pravcima koji podrazumijevaju rekombinantni gen koji rezultira otpornošću na herbicid[ glifosat (trgovački naziv Overview ), a pojednostavljuje suzbijanje korova. Ovi usjevi se zajednički komercijalno koriste u nekoliko zemalja.
Usjevi otporni na insekte: Bacillus thuringeiensis je bakterija koja prirodno proizvodi protein (Bt toksin) sa insekticidnim svojstvima, Bakterija je primijenjena na usjevima za suzbijanje i kontrolu širenja insekata, dugi niz godina, a ova praksa je široko prihvaćen u poljoprivredi i povrtlarstvu. Nedavno su razvijene biljke sa ekspresijom rekombinantnog oblika bakterijskog proteina, što može efikasno upravljati nekim od predatora insekata. Ekološka pitanja vezana uz korištenje ovih transgenih usjeva nisu u potpunosti riješena.

Historija rekombinantne DNK

Ideju o mogućnosti kreiranja rekombinantne DNA je prvi put predložio Peter Lobban, diplomirani student profesora Dalea Kaisera u Biohemijskom odjelu na Stanford University Medical School. Prve publikacije koje opisuju uspješnu proizvodnju i unutarćelijsku replikaciju rekombinantne DNK pojavile su se 1972. i 1973. Stanford University, za USA prijavljuje patent za rekombinantnu DNK, 1974. godine, navodeći da su pronalazači Stanley N. Cohen i Herbert W. Boyer; ovaj patent je nagrađen u 1980. Prvi odobreni lijek koji je generiran korištenjem tehnologije rekombinantne DNK je ljudski inzulin, koji je razvio Genentech, s licencirala ga je Eli Lilly and Company.^[10]^[11]^[12]^[13]

Reference

^ Campbell N. A., Reece J. B. (2002): Biology, 6th Ed. Addison Wesley, ISBN 0-201-75054-6.
^ Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
^ ^a ^b Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.
^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
^ http://fpc.state.gov/6176.htm biotehnologije u SAD-u: Science, Uredba i pitanja.
^ http://www.drugbank.ca/drugs/DB00030 DrugBank: Insulin Regular (DB00030) <-! Bot generated title ->.
^ http://www.drugbank.ca/molecules/19 Arhivirano 14. 12. 2011. na Wayback Machine DrugBank entry.
^ http://www.hepb.org/hepb/vaccine_information.htm Arhivirano 28. 6. 2011. na Wayback Machine Vaccine informacije hepatitis B Foundation.
^ http://www.cdc.gov/hiv/topics/testing/index.htm Arhivirano 22. 5. 2011. na Wayback Machine, testiranje na HIV US Centri za kontrolu bolesti (CDC)].
^ Lear J. (1978). Recombinant DNA: The untold story. New York: Crown Publishers. p. 43.
^ PMID 4343968 (PubMed)
^ PMID 4754844 (PubMed)
^ PMID 4594039 (PubMed)

Također pogledajte

Vanjski linkovi

Recombinant DNA fact sheet (from University of New Hampshire)
Plasmids in Yeasts (Fact sheet from San Diego State University)
Animation illustrating construction of recombinant DNA and foreign protein production by recombinant bacteria
Recombinant DNA research at UCSF and commercial application at Genentech Edited transcript of 1994 interview with Herbert W. Boyer, Living history project. Oral history.
Recombinant Protein Purification Principles and Methods Handbook Arhivirano 5. 12. 2008. na Wayback Machine

[1] Campbell N. A., Reece J. B. (2002): Biology, 6th Ed. Addison Wesley, ISBN 0-201-75054-6.

[2] Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.

[Hadžiselimović_R._2005-3] Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-3-4.

[4] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[5] ttp://fpc.state.gov/6176.htm biotehnologije u SAD-u: Science, Uredba i pitanja.

[6] ttp://www.drugbank.ca/drugs/DB00030 DrugBank: Insulin Regular (DB00030) <-! Bot generated title ->.

[7] ttp://www.drugbank.ca/molecules/19 Arhivirano 14. 12. 2011. na Wayback Machine DrugBank entry.

[8] ttp://www.hepb.org/hepb/vaccine_information.htm Arhivirano 28. 6. 2011. na Wayback Machine Vaccine informacije hepatitis B Foundation.

[9] ttp://www.cdc.gov/hiv/topics/testing/index.htm Arhivirano 22. 5. 2011. na Wayback Machine, testiranje na HIV US Centri za kontrolu bolesti (CDC)].

[10] Lear J. (1978). Recombinant DNA: The untold story. New York: Crown Publishers. p. 43.

[pmid|4343968-11] PMID 4343968 (PubMed)

[pmid|4754844-12] PMID 4754844 (PubMed)

[pmid|4594039-13] PMID 4594039 (PubMed)

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]